溫育和洗板：ELISA試劑盒溫育時間和溫度一般根據試劑盒的說明書進行選擇。溫育時可以采用水浴或者濕盒孵育,避免“邊緣效應”。①手工洗板時，拍板時要垂直，避免交叉污染，用力不能過猛，防止抗原抗體復合物脫離；②洗板機洗板時應經常檢查沖洗頭是否通暢。
顯色：市售ELISA 試劑盒中，一般是以四甲基聯苯胺(TMB)為底物的顯色液，反應條件為37℃或室溫反應15～30 min。顯色反應需要避光。
讀數和數據分析：終止后讀取結果盡量在15min內完成，讀取OD值時酶標儀需先預熱15～30 min再進行。數據分析一般用四參數和直線擬合法，選擇哪種擬合方式，可以依據標曲的相關系數（R2）來確定，R2一般需要大于0.99。
樣本的準備：ELISA試劑盒盡量使用新鮮樣本，不使用有溶血，被細菌污染、標本保存時間過長和標本凝固不全的樣本。ELISA檢測宜采集新鮮標本，如不能立即測定，5天之內應4℃保存，對于1周后檢測的樣本應低溫凍存；做好分裝，長時間凍存的樣本避免反復凍融。
仔細閱讀說明書，熟悉整個流程，推薦畫出簡要步驟圖；提前準備試劑，比如常見20X洗滌液是濃縮液，需要用超純水提前稀釋準備好。一般的檢測抗體和酶標二抗需要用對應的稀釋液稀釋至工作濃度。
不同批次的試劑不要混用，檢查各組分的有效期。
ELISA試劑盒預包被的酶標板條和各試劑組份需要室溫平衡30 min以上，這樣做的目的能使反應微孔內的溫度較快地達到所需溫度，預防后續實驗中由于孵育溫度或是時間不夠充分，而將一些弱陽性樣本不能檢出。
待測樣本加樣：待檢樣本過多時，建議分批操作；需要稀釋的樣本提前做好稀釋，注意選對合適稀釋液；控制好加樣時間，避免加樣費時過長造成誤差；注意加樣角度，垂直加入孔底，不要接觸孔壁, 做到一份樣本一個移液頭，防止交叉污染。