植物樹葉總蛋白組織樣品處理方法
對多數從動物或植物組織里提取總蛋白質而言,同樣沒有一種通用的程序。但遵循的原則基本相同。下面列出兩種提取植物樹葉總蛋白程序:
裂解液制備:
(A),7M Urea,2M Thiourea,4%(w/v)CHAPS,40mM Tris-Base,40mM DTT,2%Pharmalyte pH3-10.
(B),905M Urea, 2%(w/v)CHAPS, 0.8%(w/v)Pharmalyte pH3-10,1%(w/v)DTT and 5mM Pefabloc proteinase inhibitor;
三氯醋酸-苯酮沉淀法提取植物樹葉總蛋白程序:
- 先將植物樹葉置于液氮中速凍,后放置于Gd200組織研磨儀中研碎;
- 懸浮于含10%三氯醋酸和0.07%β-巰基乙醇的丙酮溶液,-20℃冰浴;
- 讓蛋白質沉淀過夜然后離心(4℃,40,000g,1h),棄上清液;
- 重懸沉淀浮于含0.07% β-巰基乙醇的冰預冷丙酮溶液里;
- 離心(4℃,40,000g,1h)后真空干燥沉淀;
- 用(A)或(B)裂解溶液溶解沉淀,離心(4℃,40,000g,1h);
- Brandford法定量蛋白,然后分裝保存在-78℃備用
超速離心法:
- 取材;
- 用Gd200組織研磨儀在液氮冷凍條件下將樣品研成粉末,每1g樣品加入0.5ml裂解液,使用Gd200高通量組織研磨儀研磨勻漿30s;
- 組織懸液15℃,10,000×g離心10min;
- 上清液4℃,150,000×g超速離心45min;
- 小心避開上層漂浮的脂質層,吸取離心上清6℃40,000g再次離心50min;
- 取離心上清。Brandford法定量蛋白,分裝后置-75℃保存。
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