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免疫復合物的純化

來源:上海希言科學儀器有限公司   2018年06月21日 15:08  

實驗試劑

 

裂解緩沖液

抗體

蛋白A或蛋白G微球(用含0.02%疊氮鈉裂解緩沖液配成10%(V/V)的混懸液,4℃保存)

不含DTT的Laemmli樣品緩沖液(2%SDS、10%甘油、60mmol/LTris,pH6.8和0.02%溴酚藍)

1mol/LDTT(保存于-20℃)

實驗設備

 

搖床、抽吸裝置(大多是通過導管與負壓瓶一室內真空器連接)

實驗步驟

 

1.準備工作

蛋白A或蛋白G微珠混懸液可在用前準備,4℃保存于含疊氮鈉的溶液中。

2.操作步驟

   1) 將小量裂解物樣本分別置于適當數量的1.5mlEP管中,加入裂解緩沖液,至終體積接近0.5 mol。加入抗血清(1ul)、雜交瘤細胞培養上清液(50ul)或小鼠腹水(0.5ul)作為抗體的起始用量。滴定時抗血清用0.5-5ul,雜交瘤細胞培養上清液用10~100ul,腹水用0.1~1.0ul。

   2) 冰上孵育1h。高親和力的結合反應在1h內完成。因而,1h的孵育時間可使大部分的抗體完成反應。

   3) 在抗體-抗原反應液中加入100ul蛋白A或蛋白G微球(用裂解緩沖液配制成10%混懸液),4℃搖動孵育1h。

盡管有些操作手冊建議反應過夜,但實際上并無好處,還會增加背景,因此不主張反應過夜,除某些特殊情況外。

在每一步操作的后,盡可能*去除洗滌緩沖液,有利于降低背景。建議在真空泵吸氣管末端使用23號針,或用微量加樣槍頭以減慢流速,控制微球,如果槍頭很小可直接插入微球中去除洗滌緩沖液。若微球黏附針孔,在管壁上輕彈即可去除。

4) 以10000g,4℃離心15s,收集微球。用裂解緩沖液清洗免疫復合物3次。裂解產物和洗滌緩沖液很容易通過抽吸法除去。

5) 盡可能*吸去后一次的洗滌液,將免疫復合物用于相應的實驗。

用于SDS-PAGE時,加入50ul Laemmli樣品緩沖液(2%SDS、10%甘油、100mmol/LDTT、60mmol/LTris,pH6.8和0.01%溴酚藍),加熱10min,離心,吸取上清液,將其作為樣品加入凝膠內進行電泳。若暫不進行凝膠電泳,可將樣本置于-20℃保存。

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