細(xì)胞胱硫醚-β-合成酶（Cystathionine-β-synthase；CBS）活性酶連續(xù)循環(huán)光譜法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

 細(xì)胞胱硫醚-β-合成酶（Cystathionine-β-synthase；CBS）活性酶連續(xù)循環(huán)光譜法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用胱硫醚-β-合成酶、賴氨酸脫羧酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光譜法測(cè)定其氧化后峰值（NADH濃度）的變化，以此進(jìn)行測(cè)算單位酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種動(dòng)物和人體細(xì)胞裂解懸液等胱硫醚-β-合成酶的活性檢測(cè)。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測(cè)敏感。

技術(shù)背景

胱硫醚-β-合成酶（Cystathionine-β-synthase；CBS；EC4.2.1.22），又稱為β-硫解酶（β-thiolase）或半胱氨酸合成酶（cysteine synthase），屬于水解酶（hydrolyase）家屬中的一員，作用于硫代謝中轉(zhuǎn)硫通路（transsulfuration pathway）或胱氨酸（cysteine）代謝的*步。在輔因子磷酸吡哆醛（Pyridoxal Phosphate）和S-腺苷蛋氨酸（S-adenosyl-L-methionine；adoMet）的幫助下，催化將同型胱氨酸（homocysteine）轉(zhuǎn)化為胱硫醚（cystathionine）的反應(yīng)。人體胱硫醚-β-合成酶為四體蛋白，551氨基酸。但心臟、肺、睪丸、脾臟不具有胱硫醚-β-合成酶活性。其基因突變引起胱硫醚-β-合成酶缺失，將導(dǎo)致高胱氨酸尿癥（homocystinuria），一種高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia；HHC）；而胱硫醚-β-合成酶異常高度表達(dá)，為唐氏綜合癥的特征之一。 基于底物絲氨酸（serine）和半胱氨（cysteamine）， 受到胱硫醚-β-合成酶的水解，進(jìn)而通過賴氨酸脫羧酶（Lysine decarboxylase；LDC）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase；PEPC）和蘋果酸酸脫氫酶（malate dehydrogenase；MDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），所產(chǎn)生的峰值變化（340nm），來定量分析胱硫醚-β-合成酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A） 毫升

 裂解液（Reagent B）      毫升

 緩沖液（Reagent C） 毫升

 酶促液（Reagent D）      微升

 反應(yīng)液（Reagent E）      微升

 底物液（Reagent F） 微升

 陰性液（Reagent G）   微升

產(chǎn)品說明書    1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融； 底物液（Reagent F），避免光照，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光譜分析的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于光譜分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化； 底物液（Reagent F）注意避光； 緩沖液（Reagent C）室溫下預(yù)熱。然后進(jìn)行下列操作。

• 樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）
• 小心加入xx毫升 清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升 裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測(cè)定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好上述待測(cè)樣品，置于冰槽里 
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)為340nm，間隔2分鐘，讀數(shù)6次（共10分鐘），并置零
•  緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 背景對(duì)照測(cè)定

• 移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升 酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升 反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升 底物液（Reagent F）
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入xx微升 陰性液（Reagent G）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)10分鐘

• 樣品活性測(cè)定

• 移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升 酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升 反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升 底物液（Reagent F）
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入10微升待測(cè)樣品（注意：100微克總蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)10分鐘

• 計(jì)算樣品活性

• 酶標(biāo)儀測(cè)定

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到96孔板中的所有孔里
• 分別加入xx微升 酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升 反應(yīng)液（Reagent E）
• 分別加入xx微升 底物液（Reagent F）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入xx微升 陰性液（Reagent G）或待測(cè)樣品（100微克蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和10分鐘讀數(shù)
• 活性計(jì)算

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測(cè)定只需1次
• 建議樣品忌用碳酸鹽處理
• 加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光譜測(cè)定
• 反應(yīng)測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定可以持續(xù)10分鐘
• 測(cè)定值由高到低變化，即0分鐘測(cè)定讀數(shù)高于10分鐘測(cè)定讀數(shù)，表明有酶活性
• 光譜測(cè)定后，比色皿須清洗*
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計(jì)算公式的調(diào)整（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 胱硫醚-β-合成酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 8.0條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列轉(zhuǎn)硫通路類酶學(xué)技術(shù)產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)準(zhǔn)確