冰凍切片NADH心肌黃酶活性染色試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

 冰凍切片NADH心肌黃酶活性染色試劑是一種旨在使用人工電子受體染料二甲基噻唑二苯基四唑嗅藍（MTT），受到NADH心肌黃酶催化還原，產生不溶性藍黑*素沉淀，來分析冰凍組織樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心改良傳統方法、成功實驗證明的。主要適用于動物組織細胞的心肌黃酶活性定性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，顯色清晰。

技術背景

心肌黃酶（Diaphorase），又稱為硫辛酰胺脫氫酶（lipoamide dehydrogenase），黃遞酶，二氫硫辛酰胺脫氫酶（dihydrolipoamide dehydrogenase），二氫硫辛酸脫氫酶（dihydrolipoyl dehydrogenase）等。因早期從豬心肌中提取，產品又呈現熒光的黃綠色蛋白質，故被稱為心肌黃酶。分子量102000至110000。NADH心肌黃酶直接和黃素蛋白（Flavoprotein）反應，釋放出氫原子，將氧化型黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）還原為還原型黃素腺嘌呤二核苷酸（FADH2），傳遞氫原子給氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），而形成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），作為電子供體，還原人工電子受體，例如染料四氮唑蘭（tetrazolium）化合物，包括硝基藍四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT）和二甲基噻唑二苯基四唑嗅藍（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide；MTT），產生不溶性甲暨色素，由此用于鑒別內臟神經組織等各種動物組織。

產品內容

 清理液（Reagent A）  100毫升

 染色液（Reagent B）   10毫升

 反應液（Reagent C）    1毫升

 固著液（Reagent D）   10毫升

產品說明書    1份

保存方式

保存 染色液（Reagent B）和 反應液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

培養箱：用于反應孵育

中性樹脂：用于切片封片

光學顯微鏡：用于切片染色后觀察分析

實驗步驟

染色開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下融化；移取900微升 染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入100微升 反應液（Reagent C），混勻后，標記為 染色工作液，置于冰槽里，避免光照。然后進行下列操作。

• 取出待測的10微米厚的冰凍組織切片 
• 小心加上200微升 清理液（Reagent A）在切片上，鋪滿整個樣品表面
• 小心移去切片上的 清理液（Reagent A）
• 小心加上200微升  染色工作液，鋪滿整個切片樣品表面
• 放進37℃培養箱里孵育30分鐘，避免光照
• 小心移去切片上的 染色工作液
• 小心加上200微升 清理液（Reagent A）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
• 小心移去切片上的 清理液（Reagent A）
• 重復實驗步驟6至8二次
• 小心加上200微升 固著液（Reagent D）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
• 室溫下孵育15分鐘
• 小心移去切片上的 固著液（Reagent D）
• 小心加上200微升 清理液（Reagent A）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
• 小心移去切片上的 清理液（Reagent A）
• 重復實驗步驟12至14二次
• 放上蓋玻片或封片（中性樹脂）
• 即刻在光學顯微鏡下觀察和計數：表達NADH心肌黃酶的組織細胞為陽性組織細胞，呈現藍黑色

注意事項

• 本產品為50次操作
• 操作時，須戴手套
•  反應液（Reagent C）避免反復凍融
• 陰性對照時， 染色工作液不含有 反應液（Reagent C）
• 心肌組織可以用于陽性對照
• 每次更換試劑溶液時，保持切片面基本晾干
• 試劑溶液在切片表面時，避免有氣泡存在，同時確保鋪滿切片表面
• 整個操作，在避光狀態下進行
• 染色孵育時間，根據樣品和酶活性強弱調整，通常為5至60分鐘
• 染色完成后，即刻進行光學顯微鏡觀察
• 樣品染色后保存，避免光照
• 染色參考圖像見下圖

• 本公司提供NADH心肌黃酶活性NBT染色試劑產品
• 本公司提供系列組織細胞酶活性染色試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定顯色清晰