活體細胞線粒體膜通道孔（MPTP）熒光檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

 活體細胞線粒體膜通道孔（MPTP）熒光檢測試劑是一種旨在通過鈣黃綠素－鈷技術，選擇性地聚集在線粒體內呈現熒光染色，而存在于或由線粒體釋放到細胞漿的熒光染料，即刻發生熒光淬滅，來分析和觀察線粒體膜通道孔活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種活體細胞線粒體（動物、人體、昆蟲等）膜通道孔活性（瞬時或長期開放狀態）的檢測。產品嚴格無菌，即到即用，活體檢測，分辨率高，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

線粒體膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由線粒體內外膜成分構成的非特異性且鈣離子依賴性通道。在細胞凋亡或壞死時，線粒體內容物通過膜通道孔釋放到胞漿中。膜通道孔的開放，顯著改變線粒體的通透性。鈣離子過度進入、線粒體谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等導致膜通道孔的持續開放，而造成細胞色素C的釋放和線粒體膜電位的消失。鈣黃綠素-AM，又稱雙甲亞胺二乙酸鈉熒光素－乙酰氧基甲基酯【bis（bis-carboxymethyl amino methyl fluorescein）-acetoxymethyl ester】，作為熒光探針：*，適宜的分子量622kd，小于1.5kd；第二，幾乎不具有膜結合性；第三，不是線粒體酶的底物；第四，容易進入細胞及其線粒體。鈣黃綠素-AM進入細胞后，被細胞內酯酶切離，產生具有極性的熒光性強的鈣黃綠素。鈣黃綠素進入線粒體后，被線粒體俘獲。同時胞漿內的鈣黃綠素受到其淬滅劑鈷離子的淬滅。一旦線粒體膜通道孔瞬時開放，鈣黃綠素釋放出來，被鈷離子淬滅。線粒體內鈣黃綠素熒光的變化，表明膜通道孔的開放狀態。

產品內容

 清理液（Reagent A） 100毫升

 染色液（Reagent B） 100微升

 中和液（Reagent C）  10毫升

產品說明書   1份

保存方式

保存 染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

24孔細胞培養板：用于貼壁細胞染色的容器

1.5毫升離心管：用于染色工作液配制和細胞染色的容器

微型臺式離心機：用于沉淀細胞

培養箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于細胞熒光分析

熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于細胞熒光定量分析

細胞流式儀：用于細胞熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 染色液（Reagent B）置入冰槽里融化， 中和液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預熱。然后移出5微升 染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入500微升 中和液（Reagent C），混勻后，標記為 染色工作液，置入暗室里。然后進行下列操作。

• 貼壁細胞染色

• 準備1個細胞培養24孔板的待測細胞（注意：可以使用載玻片，載玻片培養皿，35mm培養皿，和其它培養孔板，見注意事項8）
• 小心抽去細胞培養液
• 小心沿著孔壁加入500微升37℃預熱的 清理液（Reagent A）到1個細胞培養孔，覆蓋培養孔表面
• 小心抽去清理液
• 小心沿著孔壁加入500微升含有 染色液（Reagent B）和 中和液（Reagent C）的 染色工作液到1個細胞培養孔，覆蓋培養孔表面
• 放進37℃細胞培養箱里孵育20分鐘，避免光照
• 小心抽去 染色工作液
• 小心沿著孔壁加入500微升37℃預熱的 清理液（Reagent A）到細胞培養孔
• 小心抽去清理液
• 重復實驗步驟8和9一次
• 小心沿著孔壁加入500微升37℃預熱的 清理液（Reagent A）到細胞培養孔
• 選擇下列方式之一進行操作：

（A）使用倒置熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

激發波長488nm，散發波長505nm――綠色熒光減弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增強

• 使用熒光酶標儀檢測（定量檢測）：

放進熒光分光光度儀：激發波長488nm，散發波長505nm――RFU降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增強

• 懸浮細胞或脫離細胞染色

• 將懸浮細胞或脫離細胞（1 X 10⁶細胞）移入到1.5毫升離心管
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升37℃預熱的 清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升含有 染色液（Reagent B）和 中和液（Reagent C）的 染色工作液，充分混勻 
• 放進37℃細胞培養箱里孵育20分鐘，避免光照
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升37℃預熱的 清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 重復實驗步驟11至13一次
• 加入500微升37℃預熱的 清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 選擇下列方式之一進行操作：
  • 進行細胞流式儀分析（每隔5分鐘檢測一次，持續30分鐘）：波長488nm氬離子激光，觀察50000個細胞以上――

波峰左移，表明膜通道孔活性（MPTP）增強

• 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

1）移取10微升上述細胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片（每隔5分鐘檢測一次，持續30分鐘）

2）激發波長488nm，散發波長505nm――

綠色熒光減弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增強

• 或使用熒光分光光度儀檢測（定量檢測）：

1）移取500微升上述細胞懸液到1毫升比色杯

2）加入500微升 清理液（Reagent A）

3）上下傾倒混勻數次

4）放進熒光分光光度儀（每隔5分鐘檢測一次，持續30分鐘）：激發波長488nm，散發波長505nm――

RFU降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增強

注意事項

• 本產品為20次（0.5毫升體系/次）操作
• 操作時，須戴手套
• 操作時，避免污染母液
• 染色前，所有試劑溶液，除 染色液（Reagent B）外，需37℃預熱
• 建議細胞染色完成后，即刻進行熒光檢測分析
• 孵育時，必須避免光照
• 本產品友好使用于雙重染色或重疊染色
• 本產品適合各種規格的培養細胞：載玻片，載玻片培養皿，35mm培養皿，和各種培養孔板，須相應調整處理液：

• 如果不具備505nm散發波長的濾波器，可以使用505nm至530nm中的任一波長
• 如果黑色96孔板的背景讀數過高，可以選擇530nm散發波長
• 如果膜通道孔為瞬時開放（transient），則熒光緩慢且自發降低
• 本公司提供膜通道孔抑制劑：  0.2毫摩爾環胞素A（cyclosporine A）－GMS12226，維護熒光完整
• 本公司提供系列線粒體分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定熒光清晰