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Western blotting ECL 化學(xué)發(fā)光法 檢測(cè)試劑盒中文版

來(lái)源:上海銘博生物科技有限公司   2018年03月05日 15:42  

Western blotting ECL 化學(xué)發(fā)光法 檢測(cè)試劑盒

Western blotting ECL  化學(xué)發(fā)光法 檢測(cè)試劑盒 說(shuō)明書

產(chǎn)品內(nèi)容:

1. 封閉試劑:30g(可配制 400ml)。

2. 10 倍濃縮抗體稀釋液,50ml。

3. HRP 標(biāo)記二抗,0.3ml,效價(jià) 1:500-1000。

4. ECL 顯色液,25mlA+25mlB。

保存:

-20℃避光密閉保存,一年有效。若經(jīng)常使用,可將封閉試劑,抗體稀釋液和 ECL 顯色液存放于 2-8℃以方便

使用。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介:

SDS-PAGE電泳后,蛋白質(zhì)按照分子量大小分離,轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)后,固相載體以

非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì),以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與酶標(biāo)記的第

二抗體起反應(yīng),加入發(fā)光底物后,能讓膠片感光。經(jīng)顯影和定影后,可以在膠片上顯示出條帶(抗原所在位置) 。

操作步驟:(僅供參考)

常規(guī)電泳轉(zhuǎn)膜后:

1) 清洗轉(zhuǎn)印膜:將膜剝離下后,作好標(biāo)記,一般在左上角剪一缺口。室溫用 TBS-T 漂洗 3 次每次 5min,以盡量洗

去轉(zhuǎn)印膜上的 SDS,防止影響后面的抗體結(jié)合。

2) 按 5g 封閉試劑加 100ml 雙蒸水計(jì),配制膜封閉液,配好的膜封閉液為乳白色懸液,將漂洗過(guò)的轉(zhuǎn)印膜放入封

閉液內(nèi),置搖床孵育,室溫封閉 30min。用 TBS-T 緩沖液(PH7.6)洗膜,室溫漂洗 3 次每次 5min。

3) 將 10×抗體稀釋液用雙蒸水稀釋成 1×(10ml 10×抗體稀釋液加入 90ml 雙蒸水,混勻,可 4℃保存三個(gè)月) 。

此稀釋液可作為一抗和二抗的稀釋液。

4) 用 1×的抗體稀釋液稀釋一抗。根據(jù)用量以及一抗的推薦稀釋濃度來(lái)稀釋一抗。將雜交膜放入雜交袋中,加入

一抗工作液,封口,4℃孵育過(guò)夜或 37℃搖動(dòng)孵育 2h。此用過(guò)的抗體一般可回收第二天再使用一次。注:如果所

加一抗不同,可在此步將膜沿電泳方向剪成條,分別作好標(biāo)記,分開孵育。

5) 用 TBS-T 緩沖液(PH7.6)洗膜,室溫漂洗 3 次每次 5min。

6) 用 1×的抗體稀釋液稀釋二抗。根據(jù)用量,按 10ml 抗體稀釋液加入 15ul HRP 標(biāo)記二抗的比例,配制二抗工作

液。將雜交膜放入雜交袋中,加入二抗工作液,封口, 37℃搖動(dòng)孵育 1h。此用過(guò)的抗體一般可回收第二天再使

用一次。

7) 用 TBS-T 緩沖液(PH7.6)洗膜,室溫漂洗 3 次每次 10min。

8) 根據(jù)用量,取 ECL 發(fā)光液 A、B 等量混勻,加在膜正面,暗室顯色 1-5 分種。傾去顯色液,小心用紙吸去顯色

液,在上面蓋一層平整的透明紙。再取出感光膠片,做好標(biāo)記,輕輕的放在膜上,顯色 30 秒到 1 分鐘,取出膠片

浸入顯影液中,觀察顯*況,再放入定影液中 1 分鐘。根據(jù)條帶強(qiáng)弱,再次感光時(shí)可減短或者加長(zhǎng)感光時(shí)間(從

5 秒到 30 分鐘)以期達(dá)到理想結(jié)果。
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注意事項(xiàng):

1. 請(qǐng)根據(jù)一抗來(lái)源選擇試劑盒。

2. 可以根據(jù)顯色結(jié)果來(lái)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間。如背景過(guò)深,可延長(zhǎng)膜封閉時(shí)間,加長(zhǎng)zui終漂洗次數(shù)與時(shí)間。如果條

帶過(guò)弱,可增加抗體濃度,可延長(zhǎng)抗體孵育時(shí)間或加長(zhǎng)感光時(shí)間。

3. TBS-T(0.01M,PH7.6)配制方法:稱取 NaCl 8.5g ,Tris 1.21g ,用 800ml 的雙蒸水溶解,用鹽酸調(diào) PH 到 7.6,

再加入 0.5ml Tween-20,用雙蒸水 加至 1000ml,混勻即可。 (也可按照自己的配制習(xí)慣來(lái)配制)

相關(guān)產(chǎn)品:

D1060 10× 電泳轉(zhuǎn)移緩沖液

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DYF 定影粉

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