植物細胞色素P450亞酶71（PSORALEN SYNTHASE；MARMESIN）活性

液相色譜法（HPLC）定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

 植物細胞色素P450亞酶71（PSORALEN SYNTHASE；MARMESIN）活性液相色譜法（HPLC）定量檢測試劑盒是一種旨在通過探針底物異紫花前胡內酯，受到P450-71的氧化作用，進而在液相色譜儀和紫外光譜下（312nm波長）檢測分析其代謝產物，以定量測定樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種植物細胞或組織裂解萃取液樣品、純化微粒體樣品細胞色素P450亞酶CYP71的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

細胞色素P450酶屬于單加氧化酶（monooxygenase）一類的酶，其含亞鐵血紅素（heme），存在于所有生命系統內。在真核系統，為膜結合性，而原核生物，為胞漿蛋白。細胞色素P450酶共有15000種，植物細胞色素P450酶約有5000種。植物P450酶的作用在于體內內源化合物（endobiotics）和外源化合物（xenobiotics），包括除草劑（herbicides）、殺蟲劑（pesticides）、殺真菌劑（fundicides）、污染物（pollutants）的氧化代謝，即單加氧化作用（monooxygenation）和羥化作用（hydroxylation），以達到解毒效果，同時合成次級代謝產物，例如酚類、膜性固醇、植物防御素（phytoallexin）、類萜（terpenoid），以及色素、復雜性大分子（例如角質cutin、木質素lignin、軟木質suberin）和脂肪酸等。并在傷口愈合、抗蟲害、抗微生物和真菌、以及信號傳導中發揮重要作用。其中P450亞酶CYP71共有84種，占P450總量的20％，為zui大的植物P450家族。補骨脂素合成酶（Psoralen synthase）是細胞色素P450亞酶71的主要成員之一，包括大豆（soybean）71A9、A10、D8、D9、D10；茄子（Solanum melongena）A2、A4；總花貓薄荷（Nepeta racemosa）A5、A6；擬南芥A1等?；诘孜?/span>異紫花前胡內酯（marmesin）在補骨脂素合成酶的催化下，轉化為補骨脂素（psoralen），通過液相色譜儀和紫外光譜下（312nm波長）檢測分析，來定量測定細胞色素P450亞酶71的活性。其反應系統為：

產品內容

 緩沖液（Reagent A）      毫升

 反應液（Reagent B） 微升

 底物液（Reagent C）      微升

 終止液（Reagent D）   毫升

 流相液（Reagent E）      毫升

 標準液（Reagent F）    微升

產品說明書    1份

保存方式

保存 緩沖液（Reagent A）、 反應液（Reagent B）、 底物液（Reagent C）和 標準液（Reagent F）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，避免光照；試劑具有揮發性，注意密閉瓶蓋； 終止液（Reagent D）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品處理和標準液配制的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品處理

恒溫水槽或培養箱：用于樣品反應孵育

液相色譜儀（HPLC）：用于定量測定

實驗步驟

• 樣品準備 

• 準備好待測樣品，例如微粒體蛋白等
• 置于冰槽里融化

• 樣品反應

• 移取xx微升 緩沖液（Reagent A）到1.5毫升離心管
• 加入xx微升 反應液（Reagent B）
• 加入xx微升 底物液（Reagent C）
• 加入20微升待測樣品（50微克微粒體蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 槍頭抽吸混勻
• 在27℃溫度下孵育60分鐘
• 加入xx微升 終止液（Reagent D）
• 溫和渦旋震蕩5秒
• 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g
• 小心移取50微升上清液到新的1.5毫升離心管
• 放進濃縮離心機揮干
• 加入xx微升 流相液（Reagent E）
• 溫和渦旋震蕩10秒
• 即刻進行液相色譜分析（注意：如果暫時保存，建議在-20℃不超過3月）

三、測定準備

• 開啟儀器預熱15分鐘
• 根據下表設置液相色譜儀（HPLC）參數

• 運行程序

• 標準樣品配制

• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 分別加入xx微升 流相液（Reagent E）到1至5號管
• 移取xx微升 標準液（Reagent F）到1號管，混勻
• 小心移取xx微升1號管稀釋的 標準液（Reagent F）到2號管，混勻
• 小心移取xx微升2號管稀釋的 標準液（Reagent F）到3號管，混勻
• 小心移取xx微升3號管稀釋的 標準液（Reagent F）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

五、色譜分析

• 將上述配制的 標準液（Reagent F）和待測樣品放進冰槽里等待
• 每次（每個樣品）注射100微升
• 按照檢測運行程序每次（每個樣品）運行35分鐘
• 獲得色譜波峰圖：波峰面積（peak area）或峰值，保存記錄

六、計算活性

1）樣本補骨脂素濃度計算

2）樣本酶活性計算

注意事項

• 本產品為25次操作，包括標準液
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，標準液測定只需1次
• 試劑具有揮發性，注意密閉瓶蓋或使用封口膜
• 如果酶活性過低，可以增加反應時間至120分鐘
•  終止液（Reagent D）具有腐蝕性，注意操作安全
• 建議使用 流相液（Reagent E）作為陰性對照或作為基準線
• 色譜柱的異物殘留、氣泡產生、溫度未達均衡等將導致異常波峰、時間偏移等
• 用戶可以使用已知濃度的 標準液（Reagent F）作為內參標準加入到樣品中，然后進行萃取，檢測回收率（recovery）
• 補骨脂素的出峰時間（retention）以用戶操作時，使用的 標準液（Reagent F）實際出峰為準
• 建議待測樣本為微粒體，其蛋白濃度為50微克/20微升 （本公司提供   Bradford蛋白質濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 異紫花前胡內酯（S）和補骨脂素（P）HPLC的參考圖譜如下：

• 細胞色素P450亞酶71單位活性定義為：在27℃，pH 7.0條件下，每分鐘內能夠產生1納摩爾補骨脂素所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列毒理學檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感