真菌/酵母角鯊烯合成酶（squalene synthase）活性光度法定量檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

主要用途

 真菌/酵母角鯊烯合成酶（squalene synthase）活性光度法定量檢測試劑是一種旨在使用底物法尼基二磷酸，受到角鯊烯合成酶的催化過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的氧化反應， 即采用光度法測定其氧化后吸光峰值（NADPH濃度）的變化，以此進行測算單位酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種真菌/酵母裂解懸液樣品角鯊烯合成酶的活性檢測。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，反應優化，檢測敏感。

技術背景

角鯊烯合成酶（squalene synthase；EC2.5.1.21）是新（de novo）膽固醇生物合成通路中*步催化反應的酶蛋白，其包含二步反應，即通過催化2分子法尼基二磷酸（farnesyl diphosphate；FPP））縮合反應，產生前體角鯊烯二磷酸（presqualene diphosphate；PSPP），繼而在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的依賴性參與下，被還原為角鯊烯（squalene）。角鯊烯為三萜化合物（triterpenen），分子式C30H50，是植物、動物和人體中包括植物甾醇類（phytosterol）或膽固醇類生物合成的中間產物，廣泛存在于動物和植物界，以及新生兒血液中，且用于化妝品、醫藥、疫苗、食物添加等，預防心血管疾病和癌癥。角鯊烯合成酶是治療低膽固醇血癥（hypocholesterolemic）的藥物靶標。 基于底物法尼基二磷酸，受到角鯊烯合成酶的催化，同時還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADPH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADP），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析角鯊烯合成酶的活性。其反應系統為：

squalene synthase

2 FPP      →    PSPP  +  diphosphate

H⁺  +  NADPH   +  PSPP  → squalene  +  diphosphate  +  NADP⁺

產品內容

 裂解液（Reagent A）    10毫升

 強化液（Reagent B）   2毫升

 溶解液（Reagent C）   5毫升

 緩沖液（Reagent D）  20毫升

 反應液（Reagent E）       2毫升

 底物液（Reagent F）  2毫升

 陰性液（Reagent G）    1毫升

產品說明書      1份

保存方式

保存 裂解液（Reagent A）、 緩沖液（Reagent D）、 反應液（Reagent E）和 底物液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

15毫升離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

超速離心機：用于樣品操作

培養箱：用于孵育反應物

比色皿：用于光度分析的容器

分光光度儀：用于光度分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液放進冰槽里融化。然后進行下列操作。

• 樣品準備

• 準備好10毫升待測的新鮮真菌/酵母細胞（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細胞/毫升）
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管
• 置于冰槽里5分鐘
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 加入250微升 裂解液（Reagent A），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 加入100微升 強化液（Reagent B）
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里1分鐘
• 重復實驗步驟9至10五次
• 加入250微升 裂解液（Reagent A），充分混勻
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為10000g 
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的超速離心管
• 放進4℃超速離心機離心60分鐘，速度為100000g
• 小心抽去上清液
• 加入200微升 溶解液（Reagent C），混勻顆粒群
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、測定準備

• 準備好待測樣品（例如微粒體樣品等），置于冰槽里 
• 設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長為340nm，間隔2分鐘，讀數6次（共10分鐘），并置零
•  緩沖液（Reagent D）室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取730微升 緩沖液（Reagent D）到新的比色皿
• 加入100微升 反應液（Reagent E）
• 加入100微升 底物液（Reagent F）
• 放進37℃培養箱里靜置3分鐘
• 加入50微升 陰性液（Reagent G）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數10分鐘

• 樣品活性測定

• 移取730微升 緩沖液（Reagent D）到新的比色皿
• 加入100微升 反應液（Reagent E）
• 加入100微升 底物液（Reagent F）
• 放進37℃培養箱里靜置3分鐘
• 加入50微升待測樣品（注意：50微克蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品活性讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數10分鐘

• 計算樣品活性

[（樣品讀數－背景讀數）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數）X 10（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

或者

[（樣品讀數－背景讀數）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷[0.05（樣品重量；毫克）X 6.22（毫摩爾吸光系數）X 10（反應時間，分鐘）]＝單位/毫克 

單位＝微摩爾NADPH/分鐘

注意事項

• 本產品為20次操作，包括背景對照測定
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
•  強化液（Reagent B）為固體狀，移取方法為：使用1毫升槍頭，將部分剪去；或使用0.5毫升PCR管的蓋子內圈盛滿；或秤重0.1克  
• 加入樣品啟動反應后3秒內即刻光度測定
• 反應測定值由高到低變化；測定可以持續30分鐘
• 測定值由高到低變化，即0分鐘測定讀數高于10分鐘測定讀數，表明有酶活性
• 光度測定后，比色皿須清洗*
• 建議待測樣本微粒體蛋白濃度為50微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量； （本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 角鯊烯合成酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 7.4條件下，每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列ATP酶類分析技術產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測準確