食物總抗氧化能力（TAC）比色法（ABTS）定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

（中文版）

主要用途

 食物總抗氧化能力（TAC）比色法（ABTS）定量檢測試劑是一種旨在通過過硫酸鉀的參與，使染料ABTS氧化，在抗氧化劑的存在下，通過分光光度儀，觀察其峰值下降的變化，來定量檢測對應(yīng)于標(biāo)準水溶性生育酚Trolox的總抗氧化能力，即抑制氧化等值濃度的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適用于各種新鮮食物總抗氧化能力檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細胞衰老或凋亡，甚而導(dǎo)致諸如冠心病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。在生物系統(tǒng)內(nèi)，通過抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、銅藍蛋白（ceruloplasmin；CER）、鐵蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、類胡蘿卜素、抗壞血酸、還原性谷胱甘肽和尿酸膽紅素（bilirubin）等，產(chǎn)生抗氧化能力，即捕獲自由基的能力，達到消除或降低ROS的損害。通過過硫酸鉀（potassium persulfate）氧化2,2’-連氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline- 6-sulfonic acid)，diammonium salt；ABTS）產(chǎn)生的ABTS自由基，衡量體系中抗氧化劑捕獲自由基、消耗抗氧化劑的能力，在分光光度儀（730nm波長）的幫助下，觀察其峰值下降的變化，并與標(biāo)準化抗氧化劑水溶性生育酚Trolox對照。

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A）     500毫升

 緩沖液（Reagent B）      20毫升

 染色液A（Reagent C1）   1管

 染色液B（Reagent C2）   1毫升

 氧化液（Reagent D）       1毫升

 標(biāo)準液（Reagent E）     300微升

產(chǎn)品說明書   1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

50毫升燒杯：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于標(biāo)準樣品配制的容器

4℃臺式離心機：用于樣品操作

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實驗步驟

• 樣品準備

1、固態(tài)食品處理

• 秤取1克固態(tài)食品或粉末到50毫升燒杯，杯口封口膜密封
• 加入8毫升 清理液（Reagent A）
• 攪拌30分鐘，充分混勻
• 繼續(xù)加入 清理液（Reagent A）到終容量為10毫升
• 過濾紙過濾，去除不溶性固體顆粒
• 封口膜封口備用

2、液態(tài)食品處理

• 移取5毫升待測液態(tài)食品到15毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 移取上清液到新的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）可以加入適量的 清理液（Reagent A） 
• （選擇步驟）過濾紙過濾（如果離心處理，樣品仍然不清澈）
• 置于冰槽里備用或放進-20冰箱里保存

二、標(biāo)準液準備

• 準備好5個1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號管
• 移取50微升 標(biāo)準液（Reagent E）到1號管
• 小心移取10微升 緩沖液（Reagent B）和40微升 標(biāo)準液（Reagent E）到2號管，混勻
• 小心移取20微升 緩沖液（Reagent B）和30微升 標(biāo)準液（Reagent E）到3號管，混勻
• 小心移取30微升 緩沖液（Reagent B）和20微升 標(biāo)準液（Reagent E）到4號管，混勻
• 小心移取50微升 緩沖液（Reagent B）到5號管
• 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準管濃度見下表

• 樣品測讀

實驗開始前，將－20冰箱里的試劑置于室溫下融化，實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下融化，移取1毫升 染色液B（Reagent C2）到1管 染色液A（Reagent C1）里，混勻，置于暗室里室溫下孵育過夜（16小時）后，標(biāo)記為 染色工作液，避免光照。然后進行下列操作。

• 準備1個96孔板，做好標(biāo)記：空白對照孔、標(biāo)準對照孔、樣品孔
• 分別移取200微升 緩沖液（Reagent B）到96孔板里的每個孔里
• 分別加入20微升 染色工作液 
• 分別加入20微升 氧化液（Reagent D）
• 加入10微升 緩沖液（Reagent B）到空白對照孔
• 加入10微升上述配制的 標(biāo)準液（Reagent E）到相應(yīng)標(biāo)準對照孔里
• 加入10微升裂解樣品（100微克食品總量）到樣品孔里
• 輕輕搖動96孔板，使其混勻
• 室溫下孵育1分鐘
• 即刻放進酶標(biāo)儀里測讀：730nm波長
• 分析結(jié)果：
  • 構(gòu)建標(biāo)準曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位（OD730nm）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準Trolox濃度（微摩爾/升）
  • 空白對照孔為zui大吸光單位（OD730nm）讀數(shù)
  • 標(biāo)準對照孔和樣品孔為實際吸光單位（OD730nm）讀數(shù)
  • 根據(jù)標(biāo)準曲線獲得樣品對應(yīng)Trolox濃度（微摩爾/升）
  • 計算樣品實際總抗氧化能力

【根據(jù)標(biāo)準曲線獲得樣品對應(yīng)Trolox濃度（微摩爾/升）X 0.25（體系容量；毫升） X 樣品稀釋倍數(shù)】÷0.01（樣品容量；毫升）＝（微摩爾/升TROLOX等值）

• 根據(jù)下列公式計算測定體系中樣品量的總抗氧化能力（實際抑制百分率）

【（空白對照孔吸光單位讀數(shù)－實際吸光單位讀數(shù)）÷空白對照孔吸光單位讀數(shù)】X100％

• IC50：50％抑制率所需的樣品單位：TROLOX等值或樣品重量（毫克/毫升）或樣品容量（微升）

  X（所需樣品單位）＝（已知樣品單位÷實際抑制百分率）X 50％

注意事項

• 本產(chǎn)品為50次操作，包括標(biāo)準品操作
• 本產(chǎn)品測試范圍為高濃度30至150微摩爾
• 操作時，須戴手套
• 樣品制備的所有操作均須在4℃狀態(tài)下進行
• 測試前，樣品須新鮮收集
• 樣品須清澈
• 樣品避免含有Tris、EDTA和還原劑等
• 空白對照孔的吸光讀數(shù)應(yīng)為2.0以上，如果低于1.5，不能用于高濃度檢測，須增加 染色工作液的室溫孵育時間 
•  染色工作液避免反復(fù)在室溫空氣中久置。如果空白對照孔的吸光讀數(shù)為3.5以上，建議使用無離子水稀釋到2.5至3.0則可
• 樣品讀數(shù)越低，抗氧化能力越高
• 樣本量不宜超過20微升
• 可以使用比色皿檢測
• 如果樣品抗氧化劑濃度過高或過低， 建議稀釋或增加樣品濃度
• 如果測試樣品很多，建議使用排槍移液
• 如果用戶沒有730nm波長濾波器，可以使用640nm至810nm之間的任一波長替代；或者使用405nm波長替代
• 本公司提供低濃度測試試劑產(chǎn)品
• 本公司提供系列抗氧化分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感