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DNA損傷測試盒中文版說明書

來源:銘修(上海)生物科技有限公司   2017年12月28日 12:20  

DNA損傷測試盒中文版說明書

(貨號:MB1189  彗星法)

一、測定意義:

DNA在自由基(如·OH)的攻擊下容易發(fā)生損傷,即脫氧戊糖遭到破環(huán),磷酸二脂鍵的斷裂,堿基的破環(huán)或脫落,便可進一步產(chǎn)生單鏈斷裂或雙鏈斷裂。將細胞固定于低熔點瓊脂糖中,取少量細胞涂在載玻片上,用堿高鹽溶液破壞細胞膜,再用堿溶液使DNA分子解旋。將載玻片置于電泳液中,在電場的作用下,DNA分子向陽極移動。如果DNA損傷嚴重,碎片多,則電泳速度快。未受損傷的DNA大分子則由于細胞膜的阻隔,滯留在原處。用PI染色或銀染,可觀察到DNA受損的細胞形同彗星現(xiàn)象,作定性分析。也可用相關(guān)的軟件作定量分析。

二、試劑盒組份:

組份

20T

儲存條件

Lysis Bufffer

100ml

4℃保存

DMSO

8ml

4℃保存

正常熔點瓊脂糖 NMA

30mg

4℃保存

低熔點瓊脂糖 LMA

30mg

4℃保存

Propidium Iodide (PI)

400μl

4℃避光保存

三、所需儀器及自備試劑:

低速離心機、水平電泳儀、熒光顯微鏡、37℃和45℃恒溫水浴箱、載玻片、蓋玻片、平皿、微量移液器、1.5ml Microtube、0.4mmol/L Tris-HCl(pH7.5)緩沖液、PBS

四、注意事項:Propidium Iodide(PI)和EB有毒,操作時要戴手套。

五、操作步驟:

   1、細胞用冰冷的PBS洗一次,離心收集,用PBS重懸使其密度為1x106個/ml;

   2、鋪膠:下述各濃度瓊脂糖凝膠均用PBS配制,

      第1層凝膠的制備:將載玻片的磨砂面向上,45℃預(yù)熱,將預(yù)熱45℃的100μl的0.5%正常熔點瓊脂糖(NMA)鋪于載玻片上,蓋上干凈的蓋玻片,再置4℃下10min使NMA凝固。

第2層凝膠的制備:將10μl細胞(約104個)和75μl的0.7%低溶點瓊脂糖LMA(在37℃下水浴加熱至少20min使之*溶化)混合均勻。然后,輕輕揭去蓋玻片,迅速將含細胞的LMA滴到第1層瓊脂糖上,立即蓋上另一干凈蓋玻片,置4℃10min使第2層LMA凝固。

第3層凝膠的制備:第2層LMA凝固后,在室溫下小心移去蓋玻片,滴加預(yù)熱37℃的75μl的0.7%低溶點瓊脂糖LMA,如上蓋上蓋玻片4℃下凝固(第三層覆蓋第二層周圍0.5mm,增加凝膠化作用時間至30min,高濕度環(huán)境)。

3、細胞裂解:移去蓋玻片,將玻片置于平皿中,倒入預(yù)冷的Lysis Bufffer(使用前每9ml加入1ml的DMSO),4℃裂解1~2h,取出載玻片用PBS漂洗。

4、DNA堿解旋:將載玻片置于水平電泳槽。倒入新配制的堿性電泳緩沖液(用戶自備1mmol/L EDTA,300mmol/L NaOH),約覆過載玻片膠面0.25cm左右,室溫放置20~60min,以便使DNA在堿性條件下解螺旋和產(chǎn)生堿易變性區(qū)段,使DNA斷鏈在電場中易于遷移。

5、單細胞電泳:在電壓25V,電泳20~30min,電壓、電流可用改變緩沖液面高低來調(diào)節(jié)。

6、中和與染色:電泳后將載玻片置于平皿內(nèi)。加入0.4mmol/L Tris-HCl(ph7.5)緩沖液,將載玻片沒入,4℃中和三次,每次10min,棄去Tris-HCl緩沖液,每載玻片加20μl的PI染液或EB染液,蓋上蓋玻片,避光染色10min。

7、觀察、拍照和分析:熒光顯微鏡515~560nm波長的激發(fā)光、PI染色的DNA圖象呈紅色,EB染色的DNA圖象呈桔紅色,可清楚地觀察到核DNA和遷移的DNA(即慧星尾)。每個樣本隨機選擇100個細胞,測定核DNA直徑和DNA遷移的長度,可并用相應(yīng)的軟件分析。

DNA損傷按慧星尾部DNA量占全部DNA量的比例分為5級:

0級:        < 5%             無損傷;

1級:       5 ~20%          輕度損傷;

2級:       20~40%          中度損傷;

3級:       40~95%          高度損傷;

4級:       > 95%           重度損傷。

 

 

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