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植物細(xì)胞氧化應(yīng)激活性氧羥自由基原位熒光染色試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)(中文版)

來(lái)源:銘修(上海)生物科技有限公司   2017年12月28日 12:19  

 植物細(xì)胞氧化應(yīng)激活性氧羥自由基原位熒光染色試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)(中文版)

 

主要用途

 

 植物細(xì)胞氧化應(yīng)激活性氧羥自由基原位熒光染色試劑是一種旨在通過(guò)透膜熒光染色劑羥苯基熒光素,與細(xì)胞內(nèi)羥自由基的反應(yīng),產(chǎn)生綠色熒光,來(lái)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)羥自由基活性氧族的生成和增加的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。可以被用于細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、衰老、代謝等的研究。其適用于各種新鮮植物組織(例如根尖、葉片等)和培養(yǎng)細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧羥自由基的分析產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌,即到即用,操作簡(jiǎn)易,活體檢測(cè),性能穩(wěn)定,熒光清晰。

 

技術(shù)背景

 

超氧自由基陰離子(superoxide radical;O2-)、過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide;H2O2)、羥自由基或氫氧基(hydroxyl radical;OH-)、過(guò)氧化基(peroxyl radical;ROO-)、氫過(guò)氧自由基(hydroperoxyl;HOO)、烷氧自由基(alcoxyl radical)、氮氧基(nitric Oxide;NO-、過(guò)氧亞硝基陰離子(peroxynitrite anion;ONOO-次氯酸(hypochlorous acid;HOCl)、半醌自由基(semiquinone radical)、單線態(tài)氧氣(singlet oxygen)等細(xì)胞內(nèi)活性氧族(Reactive Oxygen Species;ROS)的產(chǎn)生和增多,將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。其中羥自由基或氫氧基具有極度反應(yīng)性和毒性,同時(shí)半衰期短(10-9至10-10秒)。其產(chǎn)生主要是水分子受到高能量放射后裂解、過(guò)氧化物和次氯酸反應(yīng)、過(guò)氧化氫的還原、超氧化物的歧化等形成。在植物組織中,羥自由基將啟動(dòng)放射性誘導(dǎo)損傷、攻擊植物蛋白和膜脂而引起氧化損傷。羥苯基熒光素(Hydroxyphenyl fluorescein;2-[6-(4’-Hydroxy)phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-yl]benzoic acid;HPF)是一種*自由通過(guò)細(xì)胞膜的染色劑,一旦與自由基反應(yīng),產(chǎn)生脫芐基(o-dearylation)作用,生成強(qiáng)烈熒光的熒光素(fluorescein)。據(jù)此證明植物細(xì)胞內(nèi)自由基活性氧族的存在。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

 清理液(Reagent A) 100毫升

 固著液(Reagent B)  50毫升

 離析液(Reagent C)  20毫升

 染色液(Reagent D) 100微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)   1份

 

保存方式

 

保存 染色液(Reagent D)在-20℃冰箱里,避免光照;其余的保存在4℃冰箱里; 固著液(Reagent B)和 離析液(Reagent C)具有腐蝕性,注意操作安全;有效保證6月

 

用戶(hù)自備

 

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液(GMS12024):用于細(xì)胞脫離

*細(xì)胞培養(yǎng)液(GMS12052):用于細(xì)胞操作所需的培養(yǎng)基

15毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管:用于染色液配制的容器

2毫升離心管:用于樣品操作的容器

載玻片:用于組織染色操作

解剖針:用于植物組織解剖

血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀:用于細(xì)胞計(jì)數(shù)

(微型)臺(tái)式離心機(jī):用于樣品處理

培養(yǎng)箱:用于染色孵育

比色皿或黑色96孔板:用于熒光定量分析的容器

(共聚焦)熒光顯微鏡:用于熒光分析

細(xì)胞流式儀:用于細(xì)胞染色分析

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀:用于熒光定量分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

方法一:活體組織染色

 

  • 加上100微升 清理液(Reagent A)在載玻片上
  • 切取新鮮植物根尖,放進(jìn)載玻片上的 清理液(Reagent A)
  • 解剖針小心壓碎根尖
  • 小心移去 清理液(Reagent A)
  • 小心加上1毫升 清理液(Reagent A)根尖上
  • 再加上5微升 染色液(Reagent D) 
  • 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘
  • 取出載玻片,移去染色液
  • 小心加上1毫升 清理液(Reagent A)
  • 小心移去 清理液(Reagent A)
  • 蓋上蓋玻片,用拇指小心且垂直加壓
  • 即刻在(共聚焦)熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察:激發(fā)波長(zhǎng)499nm,散發(fā)波長(zhǎng)515nm——綠色熒光增強(qiáng),表明羥自由基含量高 

 

方法二:組織固定染色

 

  • 加上100微升 清理液(Reagent A)在載玻片上
  • 切取新鮮植物根尖,放進(jìn)載玻片上的 清理液(Reagent A)
  • 解剖針小心壓碎根尖
  • 小心移去 清理液(Reagent A)
  • 小心加上2毫升 固著液(Reagent B)
  • 室溫下,孵育3小時(shí),避免干化
  • 小心移去 固著液(Reagent B)
  • 小心加上1毫升 清理液(Reagent A)
  • 小心移去 清理液(Reagent A)
  • 小心加上1毫升 離析液(Reagent C)
  • 室溫下孵育5分鐘
  • 小心移去 離析液(Reagent C)
  • 小心加上1毫升 清理液(Reagent A)
  • 小心移去 清理液(Reagent A)
  • 小心加上1毫升 清理液(Reagent A)根尖上
  • 再加上5微升 染色液(Reagent D) 
  • 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘
  • 取出載玻片,移去染色液
  • 小心加上1毫升 清理液(Reagent A)
  • 小心移去 清理液(Reagent A)
  • 蓋上蓋玻片,用拇指小心且垂直加壓
  • 即刻在(共聚焦)熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察:激發(fā)波長(zhǎng)499nm,散發(fā)波長(zhǎng)515nm——綠色熒光增強(qiáng),表明羥自由基含量高

 

方法三、培養(yǎng)植物細(xì)胞脫離染色

 

  • 準(zhǔn)備1瓶25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的待測(cè)細(xì)胞
  • 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
  • 加入3毫升  清理液(Reagent A)到細(xì)胞培養(yǎng)瓶,覆蓋培養(yǎng)瓶表面
  • 小心抽去 清理液(Reagent A)
  • 加入1毫升用戶(hù)自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液,鋪滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)平面
  • 置入37培養(yǎng)箱1分種
  • 振動(dòng)培養(yǎng)瓶,使細(xì)胞脫落
  • 加入4毫升用戶(hù)自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
  • 移入15毫升錐形離心管,充分混勻(注意:懸浮細(xì)胞直接從這一步驟開(kāi)始
  • 移取10微升在血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)
  • 移出1 X 106細(xì)胞到新的15毫升錐形離心管
  • 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入1毫升 清理液(Reagent A)
  • 再加入5微升 染色液(Reagent D),混勻
  • 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育30分鐘,避免光照
  • 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入預(yù)冷的400微升 清理液(Reagent A),輕柔混勻細(xì)胞顆粒群
  • 放進(jìn)冰槽里
  • 選擇下列方式之一進(jìn)行操作:
    • 即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析:波長(zhǎng)488nm氬離子激光觀察50000個(gè)細(xì)胞以上――

波峰右移,表明羥自由基含量高

 

  • 或使用(共聚焦)熒光顯微鏡觀察(定性檢測(cè)):

1)移取10微升上述細(xì)胞懸液到載波片上,蓋上蓋玻片

2)激發(fā)波長(zhǎng)499nm,散發(fā)波長(zhǎng)515nm――

綠色熒光增強(qiáng),表明羥自由基含量高

 

  • 或使用熒光分光光度儀檢測(cè)(定量檢測(cè)):

1)移取400微升上述細(xì)胞懸液到1毫升比色皿

2)加入600微升 清理液(Reagent A)

3)上下傾倒混勻數(shù)次

4)放進(jìn)熒光分光光度儀:激發(fā)波長(zhǎng)499nm,散發(fā)波長(zhǎng)515nm――

RFU增高,表明羥自由基含量高

 

方法四、貼壁培養(yǎng)細(xì)胞染色

 

  • 準(zhǔn)備1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)24孔板的待測(cè)細(xì)胞,細(xì)胞鋪滿(mǎn)率達(dá)70%

(注意:可以使用載玻片,載玻片培養(yǎng)皿,35mm培養(yǎng)皿,和其它培養(yǎng)孔板,見(jiàn)注意事項(xiàng)4

  • 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
  • 小心沿著孔壁加入500微升 清理液(Reagent A)到1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔,覆蓋培養(yǎng)孔表面
  • 再加入2.5微升 染色液(Reagent D)
  • 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘
  • 小心抽去染色液 
  • 小心沿著孔壁加入500微升37℃預(yù)熱的 清理液(Reagent A)到細(xì)胞培養(yǎng)孔
  • 選擇下列方式之一進(jìn)行操作:

(A) 使用倒置熒光顯微鏡觀察(定性檢測(cè)):

激發(fā)波長(zhǎng)499nm,散發(fā)波長(zhǎng)515nm――綠色熒光增強(qiáng),表明羥自由基含量高

 

  •  使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)(定量檢測(cè)):

激發(fā)波長(zhǎng)499nm,散發(fā)波長(zhǎng)515nm――RFU增高,表明羥自由基含量高

 

方法五、組織勻漿定量檢測(cè)

 

  • 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織(葉片、谷粒、種子等),并秤重以確定100毫克組織重量 
  • (選擇步驟)放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
  • (選擇步驟)加入2毫升 清理液(Reagent A)清洗1次
  • 即刻用刀片切碎組織
  • 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
  • 加入預(yù)冷的2毫升 清理液(Reagent A
  • 渦旋震蕩5秒,充分混勻
  • 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器,在冰槽里用研磨棒勻化組織(約80下)
  • 將所有組織勻漿物移入2毫升離心管,放進(jìn)4微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘,速度為5000g(或7500RPM,例如eppendorf 5415)
  • 小心移出上清液(注意:不要觸碰沉淀物)到另一個(gè)新的預(yù)冷的2毫升離心管
  • (選擇步驟)如果上清液含有肉眼可見(jiàn)的殘?jiān)貜?fù)離心5分鐘一次,速度為5000g(或7500RPM,例如eppendorf 5415)
  • (選擇步驟)即刻移入到2毫升離心管
  • 移取5微升組織勻漿物進(jìn)行蛋白定量檢測(cè):建議使用  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒(GMS30030.1)
  • 移取50微升組織勻漿物(樣品:100微克蛋白)或50微升 清理液(Reagent A(背景對(duì)照)到1毫升比色杯里
  • 加入950微升 清理液(Reagent A
  • 再加上5微升 染色液(Reagent D)
  • 上下傾倒混勻
  • 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育30分鐘,避免光照
  • 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè):激發(fā)波長(zhǎng)499nm,散發(fā)波長(zhǎng)515nm——(樣品RFU-背景對(duì)照RFU)=實(shí)際RFU:增加,表明羥自由基含量高

 

注意事項(xiàng)

 

  • 本產(chǎn)品為20次操作
  • 操作時(shí),須戴手套
  •  固著液(Reagent B) 離析液(Reagent C)具有腐蝕性,注意操作安全
  • 孵育時(shí),必須避免光照
  • 建議染色完成后,即刻進(jìn)行熒光檢測(cè)分析
  • 本產(chǎn)品適合各種規(guī)格的培養(yǎng)細(xì)胞:載玻片,載玻片培養(yǎng)皿,35mm培養(yǎng)皿,和各種培養(yǎng)孔板,須相應(yīng)調(diào)整操作用量:

操作容器

操作用量

載玻片

100微升

載玻片培養(yǎng)皿

1毫升

35mm培養(yǎng)皿

1毫升

96孔培養(yǎng)板

100微升

48孔培養(yǎng)板

200微升

24孔培養(yǎng)板

500微升

12孔培養(yǎng)板

1毫升

6孔培養(yǎng)板

2毫升

25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶

3毫升

 

  • 本產(chǎn)品適合活體染色和固定染色;建議活體染色為佳
  • 如果羥自由基濃度過(guò)低,可以延長(zhǎng)孵育時(shí)間至60分鐘
  • 根據(jù)不同組織類(lèi)型,調(diào)整 染色液(Reagent D)的使用劑量(1:20至1:1000容量比),避免過(guò)度染色
  • 激發(fā)波長(zhǎng)可以選擇在485至500nm,散發(fā)波長(zhǎng)505至550nm之間的任一波長(zhǎng)
  • 本公司提供系列活性氧分析試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰

免責(zé)聲明

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