細(xì)胞β-內(nèi)酰胺酶報(bào)告基因活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書(中文版)
細(xì)胞β-內(nèi)酰胺酶報(bào)告基因活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書(中文版)
主要用途
細(xì)胞β-內(nèi)酰胺酶報(bào)告基因活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用化學(xué)方法,快速有效地裂解動(dòng)物細(xì)胞,通過高速離心,獲得澄清細(xì)胞裂解懸液,在β-內(nèi)酰胺酶反應(yīng)體系里,以頭孢硝噻吩為黃色底物,水解所產(chǎn)生的紅色產(chǎn)物,呈現(xiàn)吸光峰值的變化,即采用比色法定量測(cè)定細(xì)胞裂解懸液制備樣品中的β-內(nèi)酰胺酶活性,藉此建立一種簡(jiǎn)單的定量評(píng)價(jià)報(bào)告基因的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和其它分子生物學(xué)研究。其適用于轉(zhuǎn)基因后的活體細(xì)胞外源性β-內(nèi)酰胺酶活性分析。產(chǎn)品即到即用,性能穩(wěn)定,參數(shù)優(yōu)化,操作簡(jiǎn)便、比色敏感。
技術(shù)背景
β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase;EC3.5.2.6)屬于細(xì)菌酶蛋白家屬的成員之一,29KD單體蛋白(monomeric)。大量細(xì)菌分泌產(chǎn)生,分布在細(xì)菌周邊和細(xì)菌細(xì)胞漿內(nèi),通過水解酰胺鍵(amide bond),分解β-內(nèi)酰胺(β-lactam)的4原子環(huán)狀結(jié)構(gòu),由此產(chǎn)生抗菌素抗性,例如青霉素類、頭孢菌素類(cephalosporins)、頭霉素類(cephamycins)、 碳青霉素烯類(Carbapenems)抗性。β-內(nèi)酰胺酶功能上分成4大組,結(jié)構(gòu)上分成4大類。β-內(nèi)酰胺酶催化反應(yīng)敏感有效,且容易測(cè)試。因此β-內(nèi)酰胺酶成為嶄新的報(bào)告基因,替代傳統(tǒng)的β-半乳糖苷酶報(bào)告基因系統(tǒng),可以在活體細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)基因轉(zhuǎn)錄、檢測(cè)蛋白間相互作用、評(píng)價(jià)基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的效果。基于頭孢硝噻吩(Nitrocefin),一種黃色底物,對(duì)于所有β-內(nèi)酰胺酶具有敏感性,在β-內(nèi)酰胺酶的催化下,水解產(chǎn)生紅色產(chǎn)物,通過486nm波長(zhǎng)的吸光峰值分析,來(lái)定量分析β-內(nèi)酰胺酶的活性。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液(Reagent A) 120毫升
裂解液(Reagent B) 10毫升
緩沖液(Reagent C) 20毫升
底物液(Reagent D) 200微升
陰性液(Reagent E) 2毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存 清理液(Reagent A)在4℃冰箱里;其余的保存在-20℃冰箱里; 底物液(Reagent D)避免光照;有效保證6月
用戶自備
15毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器
1.5毫升離心管:用于樣品操作和保存的容器
細(xì)胞刮脫棒:用于貼壁細(xì)胞脫離
(微型)臺(tái)式離心機(jī):用于樣品操作
比色皿或酶標(biāo)板:用于比色檢測(cè)的容器
恒溫水槽或培養(yǎng)箱:用于反應(yīng)物孵育
分光光度儀或酶標(biāo)儀:用于比色分析
實(shí)驗(yàn)步驟
- 樣品準(zhǔn)備
- 準(zhǔn)備好25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞(1至5 X 106細(xì)胞)
- 小心加入3毫升 清理液(Reagent A),覆蓋生長(zhǎng)表面
- 小心抽去清理液
- 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞(注意:可以使用胰酶消化)
- 加入3毫升 清理液(Reagent A),混勻細(xì)胞
- 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管(注意:懸浮細(xì)胞從這一步驟開始)
- 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g
- 小心抽去上清液
- 加入500微升 裂解液(Reagent B),充分混勻
- 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
- 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
- 置于冰槽里孵育30分鐘
- 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
- 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
- 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)(注意:建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-GMS30030.1)
- 即刻放進(jìn)-70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
- 測(cè)定準(zhǔn)備
- 開啟并設(shè)定好分光光度儀(溫度為37℃):波長(zhǎng)486nm,間隔5分鐘,讀數(shù)3次(共10分鐘),并置零
- 從-20℃冰箱里取出試劑,置于冰槽里融化; 底物液(Reagent D)避免光照
- 緩沖液(Reagent C)室溫下均衡溫度
- 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)開始前,移取20微升 底物液(Reagent D)到1.5毫升離心管,加入180微升 陰性液(Reagent E),混勻,標(biāo)記為 反應(yīng)工作液,置于暗室里備用。
- 背景對(duì)照測(cè)定
- 移取780微升 緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
- 加入100微升 反應(yīng)工作液
- 上下傾倒數(shù)次,混勻
- 在37℃溫度下孵育3分鐘
- 加入20微升 陰性液(Reagent E)
- 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))
- 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為背景空對(duì)照(10分鐘讀數(shù)-0分鐘讀數(shù))
- 樣品測(cè)定
- 移取780微升 緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
- 加入100微升 反應(yīng)工作液
- 上下傾倒數(shù)次,混勻
- 在37℃溫度下孵育3分鐘
- 加入20微升待測(cè)樣品(100微克蛋白)(注意:樣品須清澈)
- 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))
- 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為樣品讀數(shù)(10分鐘讀數(shù)-0分鐘讀數(shù))
五、計(jì)算樣品活性
[(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X 1(體系容量;毫升)X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.02(樣品容量;毫升)X 20.5(毫摩爾吸光系數(shù))X 10(反應(yīng)時(shí)間;分鐘)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克
單位=微摩爾頭孢硝噻吩/分鐘
- 酶標(biāo)板測(cè)定
- 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記:背景對(duì)照和樣品
- 分別移取195微升 緩沖液(Reagent C)到96孔板中的所有孔中
- 分別加入25微升 反應(yīng)工作液
- 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板
- 在37℃溫度下孵育3分鐘
- 分別加入5微升 陰性液(Reagent E)或待測(cè)樣品(50微克蛋白)到相應(yīng)孔中(注意:樣品須清澈)
- 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
- 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè):10分鐘讀數(shù)和0分鐘讀數(shù)
- 活性計(jì)算
[(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25(體系容量;毫升)]÷[0.005(樣品容量;毫升)X 20.5(毫摩爾吸光系數(shù))X 0.6(光徑距離;厘米)X 10(反應(yīng)時(shí)間;分鐘)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克
單位=微摩爾頭孢硝噻吩/分鐘
注意事項(xiàng)
- 本產(chǎn)品為20次(比色皿)和80次(酶標(biāo)板)操作
- 建議使用核內(nèi)表達(dá)的載體代替胞內(nèi)表達(dá)的載體轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞或組織
- 本產(chǎn)品的各項(xiàng)參數(shù)達(dá)到*化
- 操作時(shí),須戴手套
- 底物液(Reagent D)避免光照和反復(fù)凍融
- 用戶可以根據(jù)需求,配制 反應(yīng)工作液,不宜存放
- 如果用戶樣品有限,轉(zhuǎn)染困難,且酶活性過低,建議使用細(xì)胞β-內(nèi)酰胺酶報(bào)告基因活性熒光定量檢測(cè)試劑盒(GMS10093.1)
- 反應(yīng)孵育完成后,即刻進(jìn)行比色測(cè)定
- 測(cè)定值由低到高變化;測(cè)定持續(xù)10分鐘
- 比色測(cè)定后,比色皿須清洗*
- 樣本測(cè)定10分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
- 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100微克/20微升;如果樣本酶活性過低或過高, 則可以增加或降低樣本量(本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-GMS30030.1)
- 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低,可以調(diào)整樣品濃度
- β-內(nèi)酰胺酶活性單位濃度定義:在37℃溫度下,每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)(每分鐘)水解1微摩爾的頭孢硝噻吩
- 本公司提供系列β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感
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