細(xì)胞β-內(nèi)酰胺酶報(bào)告基因活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

 細(xì)胞β-內(nèi)酰胺酶報(bào)告基因活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用化學(xué)方法，快速有效地裂解動(dòng)物細(xì)胞，通過高速離心，獲得澄清細(xì)胞裂解懸液，在β-內(nèi)酰胺酶反應(yīng)體系里，以頭孢硝噻吩為黃色底物，水解所產(chǎn)生的紅色產(chǎn)物，呈現(xiàn)吸光峰值的變化，即采用比色法定量測(cè)定細(xì)胞裂解懸液制備樣品中的β-內(nèi)酰胺酶活性，藉此建立一種簡(jiǎn)單的定量評(píng)價(jià)報(bào)告基因的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和其它分子生物學(xué)研究。其適用于轉(zhuǎn)基因后的活體細(xì)胞外源性β-內(nèi)酰胺酶活性分析。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，參數(shù)優(yōu)化，操作簡(jiǎn)便、比色敏感。

技術(shù)背景

β-內(nèi)酰胺酶（β-lactamase；EC3.5.2.6）屬于細(xì)菌酶蛋白家屬的成員之一，29KD單體蛋白（monomeric）。大量細(xì)菌分泌產(chǎn)生，分布在細(xì)菌周邊和細(xì)菌細(xì)胞漿內(nèi)，通過水解酰胺鍵（amide bond），分解β-內(nèi)酰胺（β-lactam）的4原子環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由此產(chǎn)生抗菌素抗性，例如青霉素類、頭孢菌素類（cephalosporins）、頭霉素類（cephamycins）、 碳青霉素烯類（Carbapenems）抗性。β-內(nèi)酰胺酶功能上分成4大組，結(jié)構(gòu)上分成4大類。β-內(nèi)酰胺酶催化反應(yīng)敏感有效，且容易測(cè)試。因此β-內(nèi)酰胺酶成為嶄新的報(bào)告基因，替代傳統(tǒng)的β-半乳糖苷酶報(bào)告基因系統(tǒng)，可以在活體細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)基因轉(zhuǎn)錄、檢測(cè)蛋白間相互作用、評(píng)價(jià)基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的效果。基于頭孢硝噻吩（Nitrocefin），一種黃色底物，對(duì)于所有β-內(nèi)酰胺酶具有敏感性，在β-內(nèi)酰胺酶的催化下，水解產(chǎn)生紅色產(chǎn)物，通過486nm波長(zhǎng)的吸光峰值分析，來(lái)定量分析β-內(nèi)酰胺酶的活性。

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A）     120毫升

 裂解液（Reagent B）    10毫升

 緩沖液（Reagent C）    20毫升

 底物液（Reagent D）   200微升

 陰性液（Reagent E）     2毫升

產(chǎn)品說明書     1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里； 底物液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

比色皿或酶標(biāo)板：用于比色檢測(cè)的容器

恒溫水槽或培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）
• 小心加入3毫升 清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升 裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)486nm，間隔5分鐘，讀數(shù)3次（共10分鐘），并置零
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化； 底物液（Reagent D）避免光照
•  緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
• 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)開始前，移取20微升 底物液（Reagent D）到1.5毫升離心管，加入180微升 陰性液（Reagent E），混勻，標(biāo)記為 反應(yīng)工作液，置于暗室里備用。

• 背景對(duì)照測(cè)定

• 移取780微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升 反應(yīng)工作液
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升 陰性液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（10分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

• 樣品測(cè)定

• 移取780微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升 反應(yīng)工作液
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升待測(cè)樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（10分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

五、計(jì)算樣品活性

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.02（樣品容量；毫升）X 20.5（毫摩爾吸光系數(shù)）X 10（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾頭孢硝噻吩/分鐘

• 酶標(biāo)板測(cè)定

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取195微升 緩沖液（Reagent C）到96孔板中的所有孔中
• 分別加入25微升 反應(yīng)工作液
• 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入5微升 陰性液（Reagent E）或待測(cè)樣品（50微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：10分鐘讀數(shù)和0分鐘讀數(shù)
• 活性計(jì)算

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 20.5（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（光徑距離；厘米）X 10（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾頭孢硝噻吩/分鐘

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（酶標(biāo)板）操作
• 建議使用核內(nèi)表達(dá)的載體代替胞內(nèi)表達(dá)的載體轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞或組織
• 本產(chǎn)品的各項(xiàng)參數(shù)達(dá)到*化
• 操作時(shí)，須戴手套
•  底物液（Reagent D）避免光照和反復(fù)凍融
• 用戶可以根據(jù)需求，配制 反應(yīng)工作液，不宜存放
• 如果用戶樣品有限，轉(zhuǎn)染困難，且酶活性過低，建議使用細(xì)胞β-內(nèi)酰胺酶報(bào)告基因活性熒光定量檢測(cè)試劑盒（GMS10093.1）
• 反應(yīng)孵育完成后，即刻進(jìn)行比色測(cè)定
• 測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定持續(xù)10分鐘
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*
• 樣本測(cè)定10分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100微克/20微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• β-內(nèi)酰胺酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）水解1微摩爾的頭孢硝噻吩
• 本公司提供系列β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感