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細(xì)胞β-內(nèi)酰胺酶報(bào)告基因活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書(中文版)

來(lái)源:銘修(上海)生物科技有限公司   2017年12月28日 12:18  

細(xì)胞β-內(nèi)酰胺酶報(bào)告基因活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書(中文版)

 

主要用途

 

 細(xì)胞β-內(nèi)酰胺酶報(bào)告基因活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用化學(xué)方法,快速有效地裂解動(dòng)物細(xì)胞,通過高速離心,獲得澄清細(xì)胞裂解懸液,在β-內(nèi)酰胺酶反應(yīng)體系里,以頭孢硝噻吩黃色底物,水解所產(chǎn)生的紅色產(chǎn)物,呈現(xiàn)吸光峰值的變化,即采用比色法定量測(cè)定細(xì)胞裂解懸液制備樣品中的β-內(nèi)酰胺酶活性,藉此建立一種簡(jiǎn)單的定量評(píng)價(jià)報(bào)告基因的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和其它分子生物學(xué)研究。其適用于轉(zhuǎn)基因后活體細(xì)胞外源性β-內(nèi)酰胺酶活性分析。產(chǎn)品即到即用,性能穩(wěn)定,參數(shù)優(yōu)化,操作簡(jiǎn)便、比色敏感。

 

技術(shù)背景

 

β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase;EC3.5.2.6)屬于細(xì)菌酶蛋白家屬的成員之一,29KD單體蛋白(monomeric)。大量細(xì)菌分泌產(chǎn)生,分布在細(xì)菌周邊和細(xì)菌細(xì)胞漿內(nèi),通過水酰胺鍵(amide bond),分解β-內(nèi)酰胺(β-lactam)的4原子環(huán)狀結(jié)構(gòu),由此產(chǎn)生抗菌素抗性,例如青霉素類、頭孢菌素類(cephalosporins)、頭霉素類(cephamycins)、 碳青霉素烯類(Carbapenems)抗性。β-內(nèi)酰胺酶功能上分成4大組,結(jié)構(gòu)上分成4大類。β-內(nèi)酰胺酶催化反應(yīng)敏感有效,且容易測(cè)試。因此β-內(nèi)酰胺酶成為嶄新的報(bào)告基因,替代傳統(tǒng)的β-半乳糖苷酶報(bào)告基因系統(tǒng),可以在活體細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)基因轉(zhuǎn)錄、檢測(cè)蛋白間相互作用、評(píng)價(jià)基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的效果。基于頭孢硝噻吩(Nitrocefin),一種黃色底物,對(duì)于所有β-內(nèi)酰胺酶具有敏感性,在β-內(nèi)酰胺酶的催化下,水解產(chǎn)生紅色產(chǎn)物,通過486nm波長(zhǎng)的吸光峰值分析,來(lái)定量分析β-內(nèi)酰胺酶的活性。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

 清理液(Reagent A)     120毫升

 裂解液(Reagent B)    10毫升

 緩沖液(Reagent C)    20毫升

 底物液(Reagent D)   200微升

 陰性液(Reagent E)     2毫升

產(chǎn)品說明書     1份

 

保存方式

 

保存 清理液(Reagent A)在4℃冰箱里其余的保存在-20℃冰箱里; 底物液(Reagent D)避免光照;有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管:用于樣品操作和保存的容器

細(xì)胞刮脫棒:用于貼壁細(xì)胞脫離

(微型)臺(tái)式離心機(jī):用于樣品操作

比色皿或酶標(biāo)板:用于比色檢測(cè)的容器

恒溫水槽或培養(yǎng)箱:用于反應(yīng)物孵育

分光光度儀或酶標(biāo)儀:用于比色分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

  • 樣品準(zhǔn)備

 

  • 準(zhǔn)備好25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞(1至5 X 106細(xì)胞)
  • 小心加入3毫升 清理液(Reagent A),覆蓋生長(zhǎng)表面
  • 小心抽去清理液
  • 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞(注意:可以使用胰酶消化
  • 加入3毫升 清理液(Reagent A),混勻細(xì)胞
  • 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管(注意:懸浮細(xì)胞從這一步驟開始
  • 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入500微升 裂解液(Reagent B),充分混勻
  • 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
  • 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
  • 置于冰槽里孵育30分鐘
  • 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
  • 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
  • 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)(注意:建議使用  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-GMS30030.1
  • 即刻放進(jìn)-70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

  • 測(cè)定準(zhǔn)備

 

  • 開啟并設(shè)定好分光光度儀(溫度為37℃):波長(zhǎng)486nm,間隔5分鐘,讀數(shù)3次(共10分鐘),并置零
  • 從-20℃冰箱里取出試劑置于冰槽里融化; 底物液(Reagent D)避免光照
  •  緩沖液(Reagent C)室溫下均衡溫度
  • 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)開始前,移取20微升 底物液(Reagent D)到1.5毫升離心管,加入180微升 陰性液(Reagent E),混勻,標(biāo)記為 反應(yīng)工作液,置于暗室里備用。

 

  • 背景對(duì)照測(cè)定

 

  • 移取780微升 緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
  • 加入100微升 反應(yīng)工作液
  • 上下傾倒數(shù)次,混勻
  • 在37℃溫度下孵育3分鐘
  • 加入20微升 陰性液(Reagent E)
  • 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))
  • 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為背景空對(duì)照(10分鐘讀數(shù)-0分鐘讀數(shù))
  • 樣品測(cè)定

 

  • 移取780微升 緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
  • 加入100微升 反應(yīng)工作液
  • 上下傾倒數(shù)次,混勻
  • 在37℃溫度下孵育3分鐘
  • 加入20微升待測(cè)樣品(100微克蛋白)(注意:樣品須清澈
  • 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))
  • 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為樣品讀數(shù)(10分鐘讀數(shù)-0分鐘讀數(shù))

 

五、計(jì)算樣品活性

 

[(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X 1(體系容量;毫升)X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.02(樣品容量;毫升)X 20.5(毫摩爾吸光系數(shù))X 10(反應(yīng)時(shí)間;分鐘)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克

 

單位=微摩爾頭孢硝噻吩/分鐘

 

  • 酶標(biāo)板測(cè)定

 

  • 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記:背景對(duì)照和樣品
  • 分別移取195微升 緩沖液(Reagent C)到96孔板中的所有孔中
  • 分別加入25微升 反應(yīng)工作液
  • 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板
  • 在37℃溫度下孵育3分鐘
  • 分別加入5微升 陰性液(Reagent E)待測(cè)樣品(50微克蛋白)到相應(yīng)孔中(注意:樣品須清澈
  • 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
  • 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè):10分鐘讀數(shù)和0分鐘讀數(shù)
  • 活性計(jì)算

 

[(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25(體系容量;毫升)]÷[0.005(樣品容量;毫升)X 20.5(毫摩爾吸光系數(shù))X 0.6(光徑距離;厘米)X 10(反應(yīng)時(shí)間;分鐘)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克

 

單位=微摩爾頭孢硝噻吩/分鐘

 

注意事項(xiàng)

 

  • 本產(chǎn)品為20次(比色皿)和80次(酶標(biāo)板)操作
  • 建議使用核內(nèi)表達(dá)的載體代替胞內(nèi)表達(dá)的載體轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞或組織
  • 本產(chǎn)品的各項(xiàng)參數(shù)達(dá)到*化
  • 操作時(shí),須戴手套
  •  底物液(Reagent D)避免光照和反復(fù)凍融
  • 用戶可以根據(jù)需求,配制 反應(yīng)工作液,不宜存放
  • 如果用戶樣品有限,轉(zhuǎn)染困難,且酶活性過低,建議使用細(xì)胞β-內(nèi)酰胺酶報(bào)告基因活性熒光定量檢測(cè)試劑盒(GMS10093.1)
  • 反應(yīng)孵育完成后,即刻進(jìn)行比色測(cè)定
  • 測(cè)定值由低到高變化;測(cè)定持續(xù)10分鐘
  • 比色測(cè)定后,比色皿須清洗*
  • 樣本測(cè)定10分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
  • 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100微克/20微升;如果樣本酶活性過低或過高, 則可以增加或降低樣本量(本公司提供   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-GMS30030.1)
  • 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低,可以調(diào)整樣品濃度
  • β-內(nèi)酰胺酶活性單位濃度定義:在37℃溫度下,每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)(每分鐘)水解1微摩爾的頭孢硝噻吩
  • 本公司提供系列β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

 

 

免責(zé)聲明

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