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細(xì)胞尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑(uPA)活性比色法定量檢測(cè)試劑盒

來(lái)源:銘修(上海)生物科技有限公司   2017年12月28日 12:15  

細(xì)胞尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑(uPA)活性比色法定量檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)(中文版)

 

主要用途

 

 細(xì)胞尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑(uPA)活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)三肽化合物底物p-ERG-pNA受到尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的水解,釋放黃色對(duì)硝基苯胺,產(chǎn)生吸光峰值的變化,即采用比色法來(lái)測(cè)定細(xì)胞裂解萃取樣品中酶活性而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品(動(dòng)物、人體等)尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑(uPA)的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌,即到即用,操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑urokinase-type Plasminogen Activator;uPA;EC3.4.21.73),又稱為尿激酶(urokinase;UK,屬于絲氨酸蛋白酶,存在于血液、細(xì)胞外基質(zhì)和尿液中。尿激酶由411氨基酸構(gòu)成,分子量為54KD,有3個(gè)結(jié)構(gòu)域:絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域、kringle結(jié)構(gòu)域和生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域。其主要的生理性底物為纖維蛋白溶酶原Plasminogen),即纖維蛋白溶酶(plasmin)的酶原形式(zymogen),切離部位為Cys-Pro-Gly-ArgVal -Val-Gly-Gly-Cys。一旦切離后激活,纖維蛋白溶酶參與細(xì)胞蛋白水解過(guò)程,包括血栓溶解thrombolysis)和細(xì)胞外基質(zhì)降解等。uPA與組織重構(gòu)、修復(fù)、血管形成(angiogenesis)性疾病和腫瘤擴(kuò)散有關(guān)。uPA的抑制劑是絲氨酸蛋白酶抑制劑serpins),即纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑Plasminogen Activator Inhibitor;PAI)。基于人工合成的肽化合物底物p-EGR-pNA(pyro-Glu-Gly-Arg-p- Nitroaniline焦谷氨酸甘氨氨酰對(duì)硝基苯胺)受到尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的水解,釋放有色對(duì)硝基苯胺,在分光光度儀405nm 波長(zhǎng))下,測(cè)定吸光峰值的變化,來(lái)定量測(cè)定尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的活性。反應(yīng)系統(tǒng)為:

 

uPA

p-EGR-pNA-HCl                 p-EGR-OH  +   pNA

                                (黃色)

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

 清理液(Reagent A) 120毫升

 裂解液(Reagent B)  10毫升

 緩沖液(Reagent C)   2毫升

 陰性液(Reagent D)     1毫升

 底物液(Reagent E)   220微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)      1份

 

保存方式

 

保存 清理液(Reagent A)在4冰箱里;其余的保存在-20冰箱里; 底物液(Reagent E)避免光照和反復(fù)凍融;有效保證6月

用戶自備

 

15毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管:用于樣品制備和儲(chǔ)存的容器

細(xì)胞刮脫棒:用于細(xì)胞脫離

微型臺(tái)式離心機(jī):用于樣品沉淀

培養(yǎng)箱:用于反應(yīng)物孵育

96孔板或100微升1厘米光徑比色皿:用于樣品比色測(cè)定的容器

酶標(biāo)儀或分光光度儀:用于樣品比色分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的 底物液(Reagent E)置入冰槽里融化,避免光照。然后進(jìn)行下列操作。

 

  • 樣品制備

 

  • 準(zhǔn)備好75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞(15 X 107細(xì)胞)
  • 小心加入3毫升 清理液(Reagent A,覆蓋生長(zhǎng)表面
  • 小心抽去清理液
  • 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞(注意:可以使用胰酶消化
  • 加入3毫升 清理液(Reagent A,混勻細(xì)胞
  • 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管(注意:懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始
  • 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入500微升 裂解液(Reagent B,充分混勻
  • 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
  • 強(qiáng)力渦旋震蕩15
  • 置于冰槽里孵育30分鐘
  • 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415
  • 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
  • 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)(注意:建議使用  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-GMS30030.1
  • 即刻放進(jìn)-70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

  • 測(cè)定準(zhǔn)備

 

  • 準(zhǔn)備好上述制備的待測(cè)樣品
  • 設(shè)定好分光光度儀或酶標(biāo)儀(溫度為37℃):波長(zhǎng)405nm,并置零

 

  • 活性測(cè)定

 

  • 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記:背景對(duì)照和樣品
  • 分別移取85微升 緩沖液(Reagent C)到相應(yīng)孔
  • 分別加入5微升 陰性液(Reagent D)或上述制備的待測(cè)樣品(50微克蛋白)到相應(yīng)孔(注意:樣品須清澈
  • 分別加入10微升 底物液(Reagent E)
  • 輕輕搖動(dòng)96孔板(注意:避免氣泡
  • 在37℃溫度下孵育60分鐘(注意:可見(jiàn)反應(yīng)孔里呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的黃色
  • 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)或轉(zhuǎn)移到100微升比色皿,在分光光度儀里檢測(cè)
  • 活性計(jì)算:

 

  • 酶標(biāo)儀檢測(cè)

 

[(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X樣品稀釋倍數(shù)X 0.10(毫升,測(cè)定容量)]÷[0.005(樣品容量,毫升)X 10.5(毫摩爾吸光系數(shù))X 60(分鐘)X 0.6(厘米)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克

 

單位=微摩爾對(duì)硝基苯酚/分鐘

 

  • 比色皿檢測(cè)

 

[(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X樣品稀釋倍數(shù)X 0.10(毫升,測(cè)定容量)]÷[0.005(樣品容量,毫升)X 10.5(毫摩爾吸光系數(shù))X 60(分鐘)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克

 

單位=微摩爾對(duì)硝基苯酚/分鐘

 

注意事項(xiàng)

 

  • 本產(chǎn)品為21次操作,包括背景對(duì)照
  • 操作時(shí),須戴手套
  • 系統(tǒng)操作過(guò)程中,背景測(cè)定只需1次
  • 樣品須澄清,且避免反復(fù)凍融
  • 測(cè)定值由變化;測(cè)定可持續(xù)60分鐘
  • 比色測(cè)定后,比色皿須清洗*
  • 樣本測(cè)定60分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
  • 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/5微升;如果樣本酶活性過(guò)低,則可以延長(zhǎng)反應(yīng)孵育時(shí)間至16小時(shí);其次增加樣本量本公司提供   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1)
  • 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低,可以調(diào)整樣品濃度
  • 尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑單位活性定義為:在37℃,pH 7..5條件下,每分鐘內(nèi)能夠切離1微摩爾肽化合物底物p-ERG-pNA所需的酶量作為一個(gè)活性單位
  • 本公司提供系列細(xì)胞蛋白酶學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

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