細(xì)胞尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）活性比色法定量檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

 細(xì)胞尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)三肽化合物底物p-ERG-pNA受到尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的水解，釋放黃色對(duì)硝基苯胺，產(chǎn)生吸光峰值的變化，即采用比色法來(lái)測(cè)定細(xì)胞裂解萃取樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體等）尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（urokinase-type Plasminogen Activator；uPA；EC3.4.21.73），又稱(chēng)為尿激酶（urokinase；UK），屬于絲氨酸蛋白酶，存在于血液、細(xì)胞外基質(zhì)和尿液中。尿激酶由411氨基酸構(gòu)成，分子量為54KD，有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域、kringle結(jié)構(gòu)域和生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域。其主要的生理性底物為纖維蛋白溶酶原（Plasminogen），即纖維蛋白溶酶（plasmin）的酶原形式（zymogen），切離部位為Cys-Pro-Gly-Arg⊥Val -Val-Gly-Gly-Cys。一旦切離后激活，纖維蛋白溶酶參與細(xì)胞蛋白水解過(guò)程，包括血栓溶解（thrombolysis）和細(xì)胞外基質(zhì)降解等。uPA與組織重構(gòu)、修復(fù)、血管形成（angiogenesis）性疾病和腫瘤擴(kuò)散有關(guān)。uPA的抑制劑是絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpins），即纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑（Plasminogen Activator Inhibitor；PAI）。基于人工合成的三肽化合物底物p-EGR-pNA（pyro-Glu-Gly-Arg-p- Nitroaniline；焦谷氨酸酰甘氨酰精氨酰對(duì)硝基苯胺）受到尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的水解，釋放有色對(duì)硝基苯胺，在分光光度儀（405nm 波長(zhǎng)）下，測(cè)定吸光峰值的變化，來(lái)定量測(cè)定尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

uPA

p-EGR-pNA-HCl       →          p-EGR-OH  +   pNA

                                （黃色）

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A） 120毫升

 裂解液（Reagent B）  10毫升

 緩沖液（Reagent C）   2毫升

 陰性液（Reagent D）     1毫升

 底物液（Reagent E）   220微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)      1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里； 底物液（Reagent E）避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶(hù)自備

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和儲(chǔ)存的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品沉淀

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

96孔板或100微升1厘米光徑比色皿：用于樣品比色測(cè)定的容器

酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于樣品比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 底物液（Reagent E）置入冰槽里融化，避免光照。然后進(jìn)行下列操作。

• 樣品制備

• 準(zhǔn)備好75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁷細(xì)胞）
• 小心加入3毫升 清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升 裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好上述制備的待測(cè)樣品
• 設(shè)定好分光光度儀或酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)405nm，并置零

• 活性測(cè)定

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取85微升 緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里
• 分別加入5微升 陰性液（Reagent D）或上述制備的待測(cè)樣品（50微克蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
• 分別加入10微升 底物液（Reagent E）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板（注意：避免氣泡）
• 在37℃溫度下孵育60分鐘（注意：可見(jiàn)反應(yīng)孔里呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的黃色）
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)或轉(zhuǎn)移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測(cè)
• 活性計(jì)算：

• 酶標(biāo)儀檢測(cè)

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.10（毫升，測(cè)定容量）]÷[0.005（樣品容量，毫升）X 10.5（毫摩爾吸光系數(shù)）X 60（分鐘）X 0.6（厘米）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾對(duì)硝基苯酚/分鐘

• 比色皿檢測(cè)

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.10（毫升，測(cè)定容量）]÷[0.005（樣品容量，毫升）X 10.5（毫摩爾吸光系數(shù)）X 60（分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾對(duì)硝基苯酚/分鐘

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為21次操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
• 樣品須澄清，且避免反復(fù)凍融
• 測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定可持續(xù)60分鐘
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*
• 樣本測(cè)定60分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/5微升；如果樣本酶活性過(guò)低，則可以延長(zhǎng)反應(yīng)孵育時(shí)間至16小時(shí)；其次增加樣本量（本公司提供   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑單位活性定義為：在37℃，pH 7..5條件下，每分鐘內(nèi)能夠切離1微摩爾三肽化合物底物p-ERG-pNA所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列細(xì)胞蛋白酶學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感