動物全血線粒體粗提分離試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

 動物全血線粒體粗提分離試劑是一種旨在通過化學溶解以純化血白細胞、物理或化學破膜及離心處理分離出完整而純化的線粒體細胞器的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物血細胞中的線粒體的制備。其制備物產(chǎn)量高，可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、能量代謝、蛋白組學和病理生理學等的研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量和純度優(yōu)異。

技術(shù)背景

線粒體細胞器的研究是現(xiàn)代細胞生物學的zui重要的課題之一。線粒體成為生物衰老、古生物、細胞凋亡、腫瘤、HIV、老年癡呆癥、糖尿病、肌肉疾病等研究的主要對象。從任何組織或細胞分離線粒體的技術(shù)方法基本上采用：*，通過機械或化學方法破裂細胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細胞器；第三，通過高速差速離心獲得線粒體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的線粒體。

產(chǎn)品內(nèi)容

 血溶液（Reagent A）   500毫升

 清理液（Reagent B）   300毫升

 裂解液（Reagent C）    40毫升

 凈化液（Reagent D）    10毫升

 強化液（Reagent E）     5毫升

 保存液（Reagent F）   100毫升

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存 凈化液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

渦旋震蕩儀：用于混勻

4℃（微型）臺式離心機：用于樣品操作

4℃超速離心機：用于樣品操作

DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞

實驗步驟

• 白細胞分離

實驗開始前，室溫預熱的 血溶液（Reagent A），同時4℃預冷 清理液（Reagent B）。然后進行下列操作。

• 準備2個無菌的50毫升錐形離心管
• 輕輕混勻新鮮的EDTA等抗凝的全血樣品
• 分別移出5毫升全血樣品到每個50毫升錐形離心管
• 分別加入25毫升室溫預熱的 血溶液（Reagent A）
• 輕輕上下傾倒離心管5次，確保充分混勻
• 室溫下（25℃）孵育4分鐘，期間輕輕上下傾倒離心管數(shù)次（注意：血液顏色可能由不透明紅色到清澈紅色的變化）
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽掉上清液，留下500微升液體，以防抽掉白細胞顆粒群
• 用手指輕彈離心管2至3下，使白細胞顆粒群松動
• 分別加入10毫升預冷的 清理液（Reagent B），混勻細胞
• 2管50毫升錐形離心管合并為1管
• 放入臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升預冷的 清理液（Reagent B），混勻細胞
• 放入臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液，確保沒有液體殘留（注意：如果暫時停止操作，須暫時放進－70℃冰箱里）

• 白細胞線粒體分離

實驗開始前，將試劑盒里的 凈化液（Reagent D）凍融，然后移出1毫升 凈化液（Reagent D）到4毫升的 裂解液（Reagent C）里，混勻后，置入冰槽里，標記為 裂解工作液。然后進行下列操作，根據(jù)用戶要求選擇其中一種方法：

方法一：細胞勻漿法

• 加入預冷的5毫升 裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿幫勻化細胞（約20至40下）（注意：參見注意事項12）
• 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放入4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放入4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• （選擇步驟）加入3毫升預冷的 保存液（Reagent F）
• （選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心5分鐘，速度為10000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入100微升至1毫升 保存液（Reagent F），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里

方法二、化學處理法

• 加入預冷的5毫升 裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，其中每間隔一分鐘渦旋震蕩5秒
• 加入預冷的500微升 強化液（Reagent E）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，其中每間隔一分鐘渦旋震蕩5秒（注意：參見注意事項13）
• 加入預冷的5毫升 保存液（Reagent F），用手指輕彈混勻
• 放入4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放入4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• （選擇步驟）加入3毫升預冷的 保存液（Reagent F）
• （選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心5分鐘，速度為10000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入100微升至1毫升 保存液（Reagent F），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里

注意事項

• 本產(chǎn)品為10次（10毫升全血/次）操作
• 所有操作均須無菌狀態(tài)下進行
• 線粒體操作均須在4℃或以下狀態(tài)下進行
• 操作時，須戴手套
• 操作時，避免污染母液，尤其是 裂解液（Reagent B）和 保存液（Reagent E）
• 建議使用足夠的樣品量
• 建議嚴格控制操作時間
• 建議使用新鮮全血
• 建議全血樣品和 血溶液（Reagent A）充分混勻，否則造成血紅細胞的不*溶解
• 建議全血樣品和 血溶液（Reagent A）孵育時間5分鐘為佳，以防白細胞損害
• 每毫升全血平均可獲得2.5 X 10⁶白細胞
• 通常勻化次數(shù)為20至40下（或細胞顆粒群消失為止）達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
• 通常孵育5分鐘（不宜超過5分鐘）達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數(shù)
• 通常1 X 10⁷血白細胞的線粒體含量zui低為50微克線粒體蛋白

15． 如果需要計量線粒體，稀釋后數(shù)分鐘內(nèi)完成，否則線粒體將分解

16． 本產(chǎn)品所獲得的線粒體純度和產(chǎn)量zui為理想。通過調(diào)整10000g離心速度到3000至8000g，可以提高粗提的線粒體純化程度，但線粒體產(chǎn)量相應減少

17． 如果需要獲得99％以上純度的線粒體，使用 動物全血高質(zhì)純化線粒體分離試劑盒－GMS10099.3 

• 線粒體正常活性測定方法是： CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、細胞色素吸收峰譜等
• 線粒體內(nèi)外膜完整測定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和熒光JC染色
• 本公司提供線粒體套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、線粒體溶解等
• 本公司提供系列線粒體試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的線粒體內(nèi)外膜完整
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的線粒體維持正常活性
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶