應用PCR遺傳工程實驗方法

1. 設計與合成預期的末端修改的寡核苷酸引物。

例如，根據 cDNA 模板設計的 5'引物為 5' dATCATATGGCTCTG GATGAACT- GTGCCTGCTGGACATGCT3'，3' 引物為 5' dATAAGCTTTTATTAAGACA-GACTCAGCTCATGGGAGGCAA3'，這樣在 cDNA 的 5' 末端引入了 Nde  I (CATATG) 位點，改變了 cDNA 的部分密碼子為大腸桿菌偏愛密碼子。下面劃線的核苷酸表示寡核苷酸引物與 cDNA 模板之間是不同的。對于寡核苷酸引物 3' 末端*配對的堿基對數目究竟是要求多少對才能成功擴增靶基因尚無定論；然而，具體工作中發現一般有 8~10 對*配對的堿基對就足夠了。

2. 按以下次序，將各成分加入在 0.5 ml 滅菌離心管，擴增管或滅菌滴定板的孔內，混合：

100 ng 模板 DNA                   10 μl

10X 擴增緩沖液                      5 μl

20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液   5 μl

10 μmol/L 引物 1 ( 50 pmol )    5 μl

10 μmol/L 引物 2 ( 50 pmol )    5 μl

1~2 單位熱穩定 DNA 聚合酶    1 μl

H2O 補足至                            50 μl

設置二支對照反應管，加入以上除了模板 DNA 的所有試劑。在其他反應中，加 入包含模板 DNA 的所有以上試劑。通過 PCR 預期會產生陽性結果。試驗管與對照管一同進行所有后續的實驗步驟。

3. 如果 PCR 儀沒有配制加熱蓋，在反應混合液的上層應加一滴礦物油（約 50 μl)，防止樣品在 PCR 反應多個加熱與冷卻的循環過程中蒸發。如果應用熱啟動 PCR 程序，在反應混合液的上層加一層石蠟油。放置離心管和微量滴定板在 PCR 儀上。

4. 按以下方法進行 PCR 擴增。典型的程序有變性、復性和聚合（延伸反應）；相應的循環條件與溫度列表如下：

5. 抽取每種擴增樣品 5%~10%, 用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析擴增結果，用 DNA marker 來判斷擴增片段的大小。凝膠一般用 EB ( 溴化乙錠）或 SYBR 金顆粒染色后來觀察擴增的量與片段大小。

—次成功的擴增反應應該產生與我們預期大小一致的 DNA 片段。擴增條帶可用 DNA 序列分析，SoutKem 雜交和限制性內切核酸酶酶切圖譜予以鑒定。

6. 若用礦物油覆蓋在微量離心管內樣品液體的上層（步驟 3)，反應結束后可用 150 μl 抽提去除。

7. 為了后續的克隆，對 DNA 擴增片段應用相應的限制性內切核酸酶進行消化（酶切位點由引物的 5' 末端導入，上述例子應用 NdeⅠ和 HindⅢ）。應用凝膠電泳或超濾方法純化酶解片段。

8. 用預期的載體 DNA 建立適當的連接反應，連接反應中插入片段與載體的摩爾比率為 3:1。

應用PCR遺傳工程實驗方法