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純化線粒體磷氧比(ADP/O)定量檢測試劑盒產品說明書(中文版)

來源:銘修(上海)生物科技有限公司   2017年11月16日 16:15  

純化線粒體磷氧比(ADP/O定量檢測試劑盒產品說明書(中文版)

 

主要用途

 

 純化線粒體磷氧比(ADP/O定量檢測試劑是一種旨在通過極譜法檢測系統(polarographic system)測定新鮮活體線粒體在已知濃度ADP存在(III態呼吸)的情況下氧濃度的降低,來分析磷氧比(P:O ratio),以評價線粒體呼吸鏈和氧化磷酸化偶聯程度,即能量轉化效率的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。可以被用于線粒體生理功能和藥物作用機制等的研究。產品嚴格無菌,即到即用,操作簡易,活體檢測,性能穩定。

 

技術背景

 

線粒體是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心。電子傳遞和ATP合成通過質子梯度偶聯成一體,即線粒體的呼吸耗氧偶聯著ADP與Pi合成ATP的磷酸化反應。線粒體每吸收一克原子氧的同時,生長ATP(ADP磷酸化)的克分子數的比值,為ADP/O值。線粒體的磷氧比直接表征線粒體呼吸耗氧和ATP合成的關系。正常線粒體的ADP/O(P/O)為1.5:磷氧比降低意味著線粒體解偶聯;磷氧比增高意味著線粒體偶聯良好。其zui大值為3.3。

 

產品內容

 

 介質液(Reagent A)      50毫升

 底物液(Reagent B)          800微升

產品說明書  1

 

保存方式

 

保存在-20冰箱里,有效保證6月

 

用戶自備

 

CLARK氧電極儀:用于測定溶解氧濃度

 

實驗步驟

 

實驗開始前,制備好新鮮的線粒體置于冰槽里備用;同時將-20℃冰箱里的試劑融化,并預熱氧電極儀到25℃。然后進行下列操作。

 

  • 加入2.5毫升 介質液(Reagent A)到反應玻璃槽
  • 使用微型磁力子攪拌,充分混勻
  • 密封反應槽
  • 開始記錄氧濃度:起始飽和氧濃度值為0.240微摩爾分子氧/毫升(25℃)
  • 持續記錄1分鐘后,注射加入20微升待測的線粒體(總量2毫克)(注意:氧濃度可能瞬時變化
  • 持續記錄1分鐘后,注射加入20微升  底物液(Reagent B)(注意:氧濃度在10秒鐘內開始下滑;參見注意事項9
  • 持續記錄直至出現線性下行斜線出現拐點
  • 繼續注射加入20微升  底物液(Reagent B)(注意:氧濃度在10秒鐘內開始下滑 
  • 持續記錄直至出現線性下行斜線出現拐點
  • 測算氧濃度降低值(微摩爾/毫升):

 

【(*次加入底物前的氧濃度-*次下行斜線拐點時的氧濃度) +(第二次加入底物前的氧濃度-第二次下行斜線拐點時的氧濃度)】÷2(實驗次數)

 

  • 計算ADP/O: 

 

0.2微摩爾(ADP濃度)÷【氧濃度降低值(微摩爾/毫升)X 2.5(反應體系容量;毫升)X 2 (氧分子數)】

 

注意事項

 

  • 本產品為20次操作
  • 操作時,須戴手套
  • 確保反應玻璃槽潔凈,密閉,以免氧氣流入
  • 線粒體樣品須新鮮制備,建議不要凍存;制備的線粒體膜須完整,非常重要;建議使用 線粒體分離試劑盒-GMS10006.1
  • 注射加入反應槽時,避免氣泡和空氣注入
  • 避免乙醇污染;乙醇增加氧濃度;如果底物或抑制劑須使用乙醇溶解,則加注10微升
  • 保持反應槽溫度恒定,溫度降低,氧濃度升高
  • 反應液充分混勻,和環境氧保持平衡
  • 加注  底物液(Reagent B)前,須充分凍融和混勻
  • 嚴格按照規定加注試劑,切莫增加加注試劑容量
  • 氧濃度百分值轉換為微摩爾/毫升:

 

公式=【測定值(百分值)÷20.9%(環境標準氧百分值)】X 0.237(系數;微摩爾/毫升

 

  • 本公司提供系列線粒體檢測試劑產品

 

質量標準

 

  • 本產品經鑒定性能穩定
  • 本產品經鑒定檢測敏感

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