純化線粒體磷氧比（ADP/O）定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

 純化線粒體磷氧比（ADP/O）定量檢測試劑是一種旨在通過極譜法檢測系統(tǒng)（polarographic system）測定新鮮活體線粒體在已知濃度ADP存在（III態(tài)呼吸）的情況下氧濃度的降低，來分析磷氧比（P：O ratio），以評價線粒體呼吸鏈和氧化磷酸化偶聯(lián)程度，即能量轉(zhuǎn)化效率的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。可以被用于線粒體生理功能和藥物作用機制等的研究。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，活體檢測，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

線粒體是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心。電子傳遞和ATP合成通過質(zhì)子梯度偶聯(lián)成一體，即線粒體的呼吸耗氧偶聯(lián)著ADP與Pi合成ATP的磷酸化反應(yīng)。線粒體每吸收一克原子氧的同時，生長ATP（ADP磷酸化）的克分子數(shù)的比值，為ADP/O值。線粒體的磷氧比直接表征線粒體呼吸耗氧和ATP合成的關(guān)系。正常線粒體的ADP/O（P/O）為1.5：磷氧比降低意味著線粒體解偶聯(lián)；磷氧比增高意味著線粒體偶聯(lián)良好。其zui大值為3.3。

產(chǎn)品內(nèi)容

 介質(zhì)液（Reagent A）      50毫升

 底物液（Reagent B）          800微升

產(chǎn)品說明書  1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

CLARK氧電極儀：用于測定溶解氧濃度

實驗步驟

實驗開始前，制備好新鮮的線粒體置于冰槽里備用；同時將－20℃冰箱里的試劑融化，并預(yù)熱氧電極儀到25℃。然后進行下列操作。

• 加入2.5毫升 介質(zhì)液（Reagent A）到反應(yīng)玻璃槽
• 使用微型磁力子攪拌，充分混勻
• 密封反應(yīng)槽
• 開始記錄氧濃度：起始飽和氧濃度值為0.240微摩爾分子氧/毫升（25℃）
• 持續(xù)記錄1分鐘后，注射加入20微升待測的線粒體（總量2毫克）（注意：氧濃度可能瞬時變化）
• 持續(xù)記錄1分鐘后，注射加入20微升  底物液（Reagent B）（注意：氧濃度在10秒鐘內(nèi)開始下滑；參見注意事項9）
• 持續(xù)記錄直至出現(xiàn)線性下行斜線出現(xiàn)拐點
• 繼續(xù)注射加入20微升  底物液（Reagent B）（注意：氧濃度在10秒鐘內(nèi)開始下滑） 
• 持續(xù)記錄直至出現(xiàn)線性下行斜線出現(xiàn)拐點
• 測算氧濃度降低值（微摩爾/毫升）：

【（*次加入底物前的氧濃度－*次下行斜線拐點時的氧濃度） ＋（第二次加入底物前的氧濃度－第二次下行斜線拐點時的氧濃度）】÷2（實驗次數(shù)）

• 計算ADP/O： 

0.2微摩爾（ADP濃度）÷【氧濃度降低值（微摩爾/毫升）X 2.5（反應(yīng)體系容量；毫升）X 2 （氧分子數(shù)）】

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 確保反應(yīng)玻璃槽潔凈，密閉，以免氧氣流入
• 線粒體樣品須新鮮制備，建議不要凍存；制備的線粒體膜須完整，非常重要；建議使用 線粒體分離試劑盒－GMS10006.1
• 注射加入反應(yīng)槽時，避免氣泡和空氣注入
• 避免乙醇污染；乙醇增加氧濃度；如果底物或抑制劑須使用乙醇溶解，則加注10微升
• 保持反應(yīng)槽溫度恒定，溫度降低，氧濃度升高
• 反應(yīng)液充分混勻，和環(huán)境氧保持平衡
• 加注  底物液（Reagent B）前，須充分凍融和混勻
• 嚴格按照規(guī)定加注試劑，切莫增加加注試劑容量
• 氧濃度百分值轉(zhuǎn)換為微摩爾/毫升：

公式=【測定值（百分值）÷20.9%（環(huán)境標準氧百分值）】X 0.237（系數(shù)；微摩爾/毫升）

• 本公司提供系列線粒體檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感