純化線粒體呼吸控制率（RCR）定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

 純化線粒體呼吸控制率（RCR）定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過極譜法檢測(cè)系統(tǒng)（polarographic system）測(cè)定新鮮活體線粒體在ADP存在（III態(tài)呼吸）與否（IV態(tài)呼吸）的情況下溶解氧（dissolved oxygen）的消耗差異，即呼吸控制率（RCR），以評(píng)價(jià)線粒體結(jié)構(gòu)和功能完整性以及氧化磷酸化效率的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。可以被用于線粒體生理功能和藥物作用機(jī)制等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)易，活體檢測(cè)，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

線粒體是細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心。電子傳遞和ATP合成通過質(zhì)子梯度偶聯(lián)成一體。線粒體結(jié)構(gòu)完整，功能正常，底物充分，電子傳遞形成的質(zhì)子梯度不斷被消耗，電子得以順暢傳遞，氧氣快速消耗，其耗氧率大，為III態(tài)呼吸。ADP耗竭，質(zhì)子梯度不能消耗，阻礙電子傳遞，氧氣消耗減少，為IV態(tài)呼吸。 呼吸控制率（respiratory control ratio或respiratory control index；RCR），又稱呼吸調(diào)節(jié)比，是指III態(tài)（加入ADP）的呼吸速率與IV態(tài)（ADP耗竭）的呼吸速率之比。正常線粒體的RCR為3至10：RCR降低意味著線粒體ATP合成功能損傷，呼吸障礙；RCR增高意味著細(xì)胞活動(dòng)旺盛，代謝加快。

產(chǎn)品內(nèi)容

 介質(zhì)液（Reagent A）      50毫升

  IV態(tài)底物液（Reagent B）     400微升

  III態(tài)底物液（Reagent C）     400微升

產(chǎn)品說明書  1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

CLARK氧電極儀：用于測(cè)定溶解氧濃度

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，制備好新鮮的線粒體置于冰槽里備用；同時(shí)將－20℃冰箱里的試劑融化，并預(yù)熱氧電極儀到25℃。然后進(jìn)行下列操作。

• 加入2.5毫升 介質(zhì)液（Reagent A）到反應(yīng)玻璃槽
• 使用微型磁力子攪拌，充分混勻
• 密封反應(yīng)槽
• 開始記錄氧濃度：起始飽和氧濃度值為0.240微摩爾分子氧/毫升（25℃）
• 持續(xù)記錄1分鐘后，注射加入20微升待測(cè)的線粒體（總量2毫克）（注意：氧濃度可能瞬時(shí)變化）
• 持續(xù)記錄1分鐘后，注射加入20微升  IV態(tài)底物液（Reagent B）――開始IV態(tài)呼吸（注意：參見注意事項(xiàng)9）
• 持續(xù)記錄2分鐘：出現(xiàn)氧濃度緩慢下降
• 繼續(xù)注射加入20微升  III態(tài)底物液（Reagent C）（注意：氧濃度在10秒鐘內(nèi)開始下滑）――開始III態(tài)呼吸（注意：參見注意事項(xiàng)9）
• 持續(xù)記錄直至出現(xiàn)線性下行斜線出現(xiàn)拐點(diǎn)
• 分別測(cè)算III態(tài)呼吸速率和IV態(tài)呼吸速率：氧濃度降低值÷實(shí)際時(shí)間（分鐘）
• 計(jì)算呼吸控制率：III態(tài)呼吸速率÷IV態(tài)呼吸速率

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 確保反應(yīng)玻璃槽潔凈，密閉，以免氧氣流入
• 線粒體樣品須新鮮制備，建議不要凍存；制備的線粒體膜須完整，非常重要；建議使用 線粒體分離試劑盒－GMS10006.1
• 注射加入反應(yīng)槽時(shí)，避免氣泡和空氣注入
• 避免乙醇污染；乙醇增加氧濃度；如果底物或抑制劑須使用乙醇溶解，則加注10微升
• 保持反應(yīng)槽溫度恒定，溫度降低，氧濃度升高
• 反應(yīng)液充分混勻，和環(huán)境氧保持平衡
• 加注  IV態(tài)底物液（Reagent B）和  III態(tài)底物液（Reagent C）前，須充分凍融和混勻
• 嚴(yán)格按照規(guī)定加注試劑，切莫增加加注試劑容量
• 本公司提供系列線粒體檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感