MB10135.2 v.A

   冰凍切片氧化應激活性氧次氯酸離子熒光測定試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

   冰凍切片氧化應激活性氧次氯酸離子熒光測定試劑盒是一種旨在通過透膜熒光染色劑氨苯基熒光素，與細胞內次氯酸陰離子的反應，產生綠色熒光，來測定細胞內次氯酸活性氧族的生成和增加的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適宜于冰凍動物組織的次氯酸陰離子分析。可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、衰老、代謝和營養學等的研究。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，活體檢測，性能穩定。

技術背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，將導致細胞衰老或凋亡。次氯酸陰離子與細胞膜成分反應，氧化質膜上氫硫基團，通過胺和不飽和脂肪酸的氯離子化和破壞鐵硫中心，達到干擾細胞功能，包括葡萄糖和氨基酸轉運和鉀泵能力。氨苯基熒光素（Aminophenyl fluorescein；2-[6-(4’-Amino) phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-yl]benzoic acid；APF）是一種*自由通過細胞膜的熒光染色劑，選擇性與次氯酸陰離子反應，生成強烈熒光的熒光素（fluorescein），同時在羥苯基熒光素（Hydroxyphenyl fluorescein；2-[6-(4’-Hydroxy) phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-yl]benzoic acid；HPF）的對比存在下，排除其它活性氧族的干擾。據此證明組織細胞內次氯酸活性氧族的存在。 

產品內容

   清理液（Reagent A）     20毫升

   染色液（Reagent B）     50微升

   本底液（Reagent C）     50微升

   稀釋液（Reagent D）     20毫升

產品說明書 1份

保存方式

保存   染色液（Reagent B）和   本底液（Reagent C）在－20℃冰箱里，嚴格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于細胞染色的容器

培養箱：用于反應孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于觀察熒光細胞

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的   染色液（Reagent B）和   本底液（Reagent C）置入冰槽里融化，   稀釋液（Reagent D）放進37℃恒溫水槽里預熱。然后移出5微升   染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入995微升   稀釋液（Reagent D），混勻后，標記為   染色工作液，置入暗室里；同時移出5微升   本底液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管，加入995微升   稀釋液（Reagent D），混勻后，標記為   本底工作液，置入暗室里。然后進行下列操作。

• 準備2片同一切面厚為10微米的未經固著處理的待測冰凍切片：標記為樣本和本底
• 置于室溫下，分別小心加上500微升預冷的   清理液（Reagent A），鋪滿整個切片表面
• 分別小心移去切片上的   清理液（Reagent A）
• 小心加上500微升室溫預熱的   染色工作液到樣本切片上，鋪滿整個切片表面
• 小心加上500微升室溫預熱的   本底工作液到本底切片上，鋪滿整個切片表面
• 在37℃濕潤培養箱里，孵育30分鐘，避免光照（注意：避免液體蒸發）
• 分別小心移去切片上的   染色工作液和   本底工作液
• 分別小心加上500微升   清理液（Reagent A），鋪滿整個切片表面
• 分別小心移去切片上的   清理液（Reagent A）
• 放上蓋玻片或封片
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下觀察：激發波長499nm，散發波長515nm――（樣本綠色熒光—本底綠色熒光）增強，表明次氯酸陰離子含量高

注意事項

• 本產品為20次操作
• 建議使用新鮮組織（手術切除后1小時內）制成的冰凍切片
• 操作時，須戴手套
•    染色工作液和   本底工作液，避免光照
• 孵育時，須避免光照
• 建議組織染色完成后，即刻進行熒光定性分析
• 根據細胞類型，同步調整   染色工作液和   本底工作液使用劑量（1：200至1：1000容量比），避免過度染色
• 如果次氯酸陰離子濃度過低，可以延長孵育時間至60分鐘
• 激發波長可以選擇在485至500nm，散發波長505至550nm之間的任一波長
• 本公司同時提供系列次氯酸活性氧檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定熒光清晰