MB10149.2 v.A

   冰凍切片過氧亞硝基陰離子活性氧（ONOO^-）熒光測定試劑盒產品說明書

（中文版）

主要用途

   冰凍切片過氧亞硝基陰離子活性氧（ONOO^-）熒光測定試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑二氫羅丹明123，在組織細胞氧化條件下，產生綠色熒光，來定量檢測組織細胞內過氧亞硝基陰離子活性氧族的生成和增加的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。可以被用于一氧化氮代謝、細胞凋亡、信號傳遞、衰老、代謝和營養學等的研究。適宜于冰凍動物組織的分析。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，定性檢測，性能穩定。

技術背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，將導致細胞衰老或凋亡。其中過氧亞硝基陰離子是由亞硝酸和過氧化氫反應或超氧陰離子與一氧化氮反應所產生，成為強力氧化劑和硝酸化劑，進而與細胞內的硫氫基（sulphydrils）、金屬分子、二氧化碳、酪氨酸殘基等目標分子反應，引起細胞，包括DNA和蛋白大分子的損傷，導致各種炎癥、血管硬化和神經退行性病變等。作為過氧亞硝基陰離子的特異性熒光探針二氫羅丹明123（dihydrorhodamine 123；DHR），是一種*自由通過細胞膜的染色劑。一旦受到過氧亞硝基陰離子的氧化，便釋放出產生強力綠色熒光的羅丹明123（rhodamine 123）。據此測定組織細胞內過氧亞硝基陰離子活性氧族的濃度。 

產品內容

   清理液（Reagent A）    20毫升

   染色液（Reagent B）    40微升

   稀釋液（Reagent C）    10毫升

產品說明書 1份

保存方式

保存   染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

培養箱或恒溫水槽：用于染色孵育

熒光顯微鏡：用于觀察熒光組織

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的   染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，   稀釋液（Reagent C）置于室溫預熱。然后移出10微升   染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入990微升   稀釋液（Reagent C），混勻后，標記為   染色工作液，置入暗室里。然后進行下列操作。

• 準備5片待測的厚為10微米的未經固著處理的冰凍切片
• 置于室溫下，小心加上500微升預冷的   清理液（Reagent A），鋪滿整個切片表面
• 小心移去切片上的   清理液（Reagent A）
• 小心加上200微升室溫預熱的   染色工作液，鋪滿整個切片表面
• 在37℃濕潤培養箱里，孵育20分鐘（注意：避免液體蒸發）
• 小心移去切片上的   染色工作液，避免光照
• 小心加上500微升   清理液（Reagent A），鋪滿整個切片表面
• 小心移去切片上的   清理液（Reagent A）
• 放上蓋玻片或封片
• 即刻在熒光顯微鏡下觀察（定性檢測）：激發波長480nm或500nm，散發波長530nm――綠色熒光增強，表明過氧亞硝基陰離子活性氧族（ONOO^-）含量高

注意事項

• 本產品為20次操作
• 建議使用新鮮組織（手術切除后1小時內）制成的冰凍切片
• 操作時，須戴手套
•    染色工作液避免光照
• 孵育時，須避免光照
• 建議組織染色完成后，即刻進行熒光定性分析
• 如果背景熒光強度過大，可以稀釋   染色工作液10至1000倍
• 可以使用2.5微摩爾尿酸或25微摩爾半胱氨酸（cysteine），觀察細胞熒光減弱或消失現象
• 本公司提供過氧亞硝基陰離子解構劑和清除劑溶液
• 本公司提供系列活性氧檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定熒光清晰