MB10103.5 v.A

 植物琥珀酸脫氫酶活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

 植物琥珀酸脫氫酶（SDH）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在使用合成電子受體染料，通過反應(yīng)系統(tǒng)測定染料還原后峰值的降低，即采用比色法測算樣品中單位酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種植物組織，包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）等裂解懸液中琥珀酸脫氫酶的特異性活性檢測。用于衰老、能量代謝、蛋白組學(xué)等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測敏感。

技術(shù)背景

琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase；SDH；EC 1.3.99.1）是三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle；TCA）或Krebs循環(huán)中與細胞線粒體膜相關(guān)的重要元素，位于線粒體內(nèi)膜，參與細胞呼吸鏈。琥珀酸脫氫酶由27kd和70kd兩個單體組成。其功能在于催化琥珀酸（succinate）的氧化反應(yīng)，產(chǎn)生延胡索酸（furmarate），通過黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide；FAD）傳遞電子?；?/span>琥珀酸脫氫酶的反應(yīng)原理，使用人工電子受體染料二氯靛酚鈉（2,6-Dichloroindophenol sodium；DCIP），接受來自還原型黃素腺嘌呤二核苷酸（Reduced flavin Adenine Dinucleotide；FADH₂）的電子，而被還原，在分光光度儀下，其吸光值（600nm波長）的變化，來測算琥珀酸脫氫酶的活性。其反應(yīng)方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A）   毫升

 裂解液（Reagent B）        毫升

 緩沖液（Reagent C）   毫升

 反應(yīng)液（Reagent D）   毫升

 底物液（Reagent E）     毫升

 陰性液（Reagent F）   微升

產(chǎn)品說明書      1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）和 緩沖液（Reagent C）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融； 反應(yīng)液（Reagent D）含有毒性物質(zhì)，避免直接用手接觸； 底物液（Reagent E），避免光照，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

DOUNCE勻漿器：用于組織勻化

4℃（微型）臺式離心機：用于樣品處理

恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于反應(yīng)物孵育

比色皿：用于比色測定的容器

分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化； 底物液（Reagent E）注意避光。然后進行下列操作。

一、樣品準備

• 準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升 清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進一個預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的xx毫升 裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放進預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）
• 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管，放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復(fù)離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 即刻移入到1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

二、測定準備

• 準備好待測樣品，置于冰槽里
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長600nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零

• 背景對照測定

• 移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升 反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入xx微升 底物液（Reagent E）
• 放進25℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入xx微升 陰性液（Reagent F）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：OD0分鐘－OD5分鐘 

• 樣品活性測定

• 移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升 反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入xx微升 底物液（Reagent E）
• 放進25℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入100微升待測樣品（注意：100微克組織總蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：OD0分鐘－OD5分鐘

• 計算樣品活性

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照測定
• 操作時，須戴手套
•  反應(yīng)液（Reagent D）含有毒性物質(zhì)，避免直接用手接觸
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 加入樣品后3秒內(nèi)即刻比色測定
• 比色測定初始讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)）0.8左右為理想狀態(tài)
• 反應(yīng)1分鐘后比色測定值趨于穩(wěn)定；測定值由高到低變化；測定持續(xù)5分鐘
• 測定值由高到低變化，即5分鐘測定讀數(shù)低于0分鐘測定讀數(shù)，表明有酶活性
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 建議待測樣本組織總蛋白濃度為100微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調(diào)整（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 活性計算時，可以選擇5分鐘內(nèi)單位時間zui大線性變化的吸光值
• 琥珀酸脫氫酶單位活性定義為：在25℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠還原1微摩爾氧化型二氯靛酚鈉（DCIP）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列細胞酶學(xué)技術(shù)產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準確