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細(xì)胞-組織溶酶體粗提分離試劑盒產(chǎn)品說明書(中文版)

來源:銘修(上海)生物科技有限公司   2017年10月13日 11:16  

細(xì)胞/組織溶酶體粗提分離試劑盒產(chǎn)品說明書(中文版)

 

主要用途

 

  細(xì)胞/組織溶酶體粗提分離試劑是一種旨在從動(dòng)物細(xì)胞或組織中分離出完整而純化的溶酶體細(xì)胞器的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適合于動(dòng)物軟組織(肝或腦組織)和培養(yǎng)細(xì)胞的溶酶體的制備。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶,即到即用,性能穩(wěn)定,分離產(chǎn)量和純度俱佳

 

技術(shù)背景

 

溶酶體(lysosome)是一種普遍存在于真核細(xì)胞中的細(xì)胞器,含有酸性水解酶,例如酯酶、淀粉酶、蛋白酶、核酶等,分解各種細(xì)胞殘?jiān)蛷U棄物質(zhì),包括過多的或破損的其它細(xì)胞器、食物顆粒、吞噬的細(xì)菌和病毒等。其大小為0.5至1.5微米,球圓形,溶酶體內(nèi)pH為5.0左右。溶酶體功能異常會(huì)引起溶酶體貯積癥1ysosomal storage disordersLSDs),例如家族性*病(Tay-sachs disease龐貝氏癥 Pompes disease)。溶酶體細(xì)胞器的分離是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究的zui常用的手段之一。從任何組織或細(xì)胞分離溶酶體的技術(shù)方法基本上采用:*,通過機(jī)械或化學(xué)方法破裂細(xì)胞;第二,通過低速差速離心去除殘?jiān)樾己途薮蠹?xì)胞器;第三,通過高速差速離心獲得溶酶體;甚至,第四,可以通過等密度離心獲得純度更高的溶酶體。 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

  清理液(Reagent A)   毫升

  裂解液(Reagent B)   毫升

  凈化液(Reagent C)   毫升

  強(qiáng)化液(Reagent D)   毫升

  分離液(Reagent E   毫升

  保存液(Reagent F   毫升

產(chǎn)品說明書   1

 

保存方式

 

保存  凈化液(Reagent C)在-20冰箱里,其余的保存在4冰箱里,有效保證6月

 

用戶自備

 

HANK平衡鹽緩沖溶液(GMS12028)或PBS緩沖溶液(GMS12033):用于清理細(xì)胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液(GMS12024):用于細(xì)胞脫離

*細(xì)胞培養(yǎng)液(GMS12052):用于細(xì)胞處理所需的培養(yǎng)基

15毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管:用于樣品操作的容器

4臺式離心機(jī):用于沉淀細(xì)胞

4超速離心機(jī):用于分離細(xì)胞器成分

DOUNCE勻漿器:用于裂解組織細(xì)胞

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

  • 動(dòng)物軟組織溶酶體分離(組織勻漿法)

 

實(shí)驗(yàn)開始前,將-20冰箱里的  凈化液(Reagent C)取出凍融,然后移出xx毫升  凈化液(Reagent C)xx毫升的  裂解液(Reagent B)到15毫升錐形離心管里,混勻后,標(biāo)記為  裂解工作液,放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

 

  • 手術(shù)取出動(dòng)物組織,并秤重以確定1克組織重量(實(shí)驗(yàn)前使動(dòng)物空腹12至24小時(shí))
  • (選擇步驟)放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
  • (選擇步驟)加入xx毫升  清理液(Reagent A)清洗1次
  • 即刻用刀片切碎組織
  • 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
  • 加入xx毫升預(yù)冷的  裂解工作液
  • 渦旋震蕩5秒,充分混勻
  • 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
  • 在冰槽里用勻漿棒勻化組織(約20至40下)(注意:參見注意事項(xiàng)8
  • 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
  • 放進(jìn)4臺式離心機(jī)離心10分鐘,速度為1000g
  • 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
  • 放進(jìn)4超速離心機(jī)離心10分鐘,速度為12000g
  • 小心抽去上清液,保留沉淀顆粒 
  • 加入xx毫升預(yù)冷的  分離液(Reagent E),混勻
  • 置于冰槽里孵育15分鐘
  • 放進(jìn)4超速離心機(jī)離心15分鐘,速度為25000g
  • 小心抽去上清液,保留沉淀顆粒——此步驟獲得溶酶體沉淀物
  • (選擇步驟)加入xx毫升預(yù)冷的  保存液(Reagent F
  • (選擇步驟)放進(jìn)4超速離心機(jī)再次離心15分鐘,速度為25000g
  • (選擇步驟)小心抽去上清液
  • 加入xx微  保存液(Reagent F,充分混勻
  • 即刻移入1.5毫升離心管,放進(jìn)-70冰箱里

 

二、動(dòng)物軟組織溶酶體分離(化學(xué)處理法)

 

實(shí)驗(yàn)開始前,將-20℃冰箱里的  凈化液(Reagent C)取出凍融,然后移出xx毫升  凈化液(Reagent C)xx毫升的  裂解液(Reagent B)到15毫升錐形離心管里,混勻后,標(biāo)記為  裂解工作液,放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

 

  • 手術(shù)取出動(dòng)物組織,并秤重以確定1克組織重量(實(shí)驗(yàn)前使動(dòng)物空腹12至24小時(shí))
  • (選擇步驟)放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
  • (選擇步驟)加入xx毫升  清理液(Reagent A)清洗1次
  • 移入一個(gè)液氮凍存管
  • 即刻放入液氮罐過夜
  • 次日從液氮罐里取出,即刻(zui快速度)碾碎組織成粉末(注意:切莫使組織凍融
  • 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
  • 加入xx毫升預(yù)冷的  裂解工作液
  • 渦旋震蕩5秒,充分混勻
  • 在冰槽里孵育2分鐘,期間渦旋震蕩5秒一次
  • 加入xx微升預(yù)冷的  強(qiáng)化液(Reagent D)
  • 渦旋震蕩5秒,充分混勻
  • 在冰槽里孵育5分鐘,期間渦旋震蕩5秒二次(注意:參見注意事項(xiàng)9
  • 加入xx毫升預(yù)冷的  保存液(Reagent E),輕輕搖動(dòng)試管混勻
  • 放進(jìn)4臺式離心機(jī)離心10分鐘,速度為1000g
  • 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
  • 放進(jìn)4超速離心機(jī)離心10分鐘,速度為12000g
  • 小心抽去上清液,保留沉淀顆粒 
  • 加入xx毫升預(yù)冷的  分離液(Reagent E),混勻
  • 置于冰槽里孵育15分鐘
  • 放進(jìn)4超速離心機(jī)離心15分鐘,速度為25000g
  • 小心抽去上清液,保留沉淀顆粒——此步驟獲得溶酶體沉淀物
  • (選擇步驟)加入3毫升預(yù)冷的  保存液(Reagent F
  • (選擇步驟)放進(jìn)4超速離心機(jī)再次離心15分鐘,速度為25000g
  • (選擇步驟)小心抽去上清液
  • 加入500微  保存液(Reagent F,充分混勻
  • 即刻移入1.5毫升離心管,放進(jìn)-70冰箱里

 

三、動(dòng)物細(xì)胞溶酶體分離(細(xì)胞勻漿法)

 

實(shí)驗(yàn)開始前,將-20℃冰箱里的  凈化液(Reagent C)取出凍融,然后移出xx毫升  凈化液(Reagent C)xx毫升的  裂解液(Reagent B)到15毫升錐形離心管里,混勻后,標(biāo)記為  裂解工作液,放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

 

  • 準(zhǔn)備5至10瓶75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞(107),直至細(xì)胞生長鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面
  • 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶,覆蓋培養(yǎng)瓶表面,然后抽去
  • 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2一次
  • 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液,鋪滿整個(gè)細(xì)胞生長表面
  • 置入37培養(yǎng)箱3分種
  • 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶,使細(xì)胞脫落,
  • 分別加入10毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
  • 移入一個(gè)50毫升錐形離心管
  • 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘,速度為200g
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx毫升預(yù)冷的  清理液(Reagent A),混勻細(xì)胞
  • 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘,速度為300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx毫升預(yù)冷的  裂解工作液
  • 渦旋震蕩5秒,充分混勻細(xì)胞顆粒群
  • 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
  • 在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞(約20至40下)(注意:參見注意事項(xiàng)8
  • 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
  • 放進(jìn)4臺式離心機(jī)離心10分鐘,速度為1500g
  • 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
  • 放進(jìn)4超速離心機(jī)離心10分鐘,速度為12000g
  • 小心抽去上清液,保留沉淀顆粒 
  • 加入xx毫升預(yù)冷的  分離液(Reagent E),混勻
  • 置于冰槽里孵育15分鐘
  • 放進(jìn)4超速離心機(jī)離心15分鐘,速度為25000g
  • 小心抽去上清液,保留沉淀顆粒——此步驟獲得溶酶體沉淀物
  • (選擇步驟)加入xx毫升預(yù)冷的  保存液(Reagent F
  • (選擇步驟)放進(jìn)4超速離心機(jī)再次離心15分鐘,速度為25000g
  • (選擇步驟)小心抽去上清液
  • 加入x微  保存液(Reagent F,充分混勻
  • 即刻移入1.5毫升離心管,放進(jìn)-70冰箱里

 

四、動(dòng)物細(xì)胞溶酶體分離(化學(xué)處理法)

 

實(shí)驗(yàn)開始前,將-20℃冰箱里的  凈化液(Reagent C)取出凍融,然后移出xx毫升  凈化液(Reagent C)xx毫升的  裂解液(Reagent B)到15毫升錐形離心管里,混勻后,標(biāo)記為  裂解工作液,放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

 

  • 準(zhǔn)備5至10瓶75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞(108),直至細(xì)胞生長鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面
  • 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶,覆蓋培養(yǎng)瓶表面,然后抽去
  • 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2一次
  • 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液,鋪滿整個(gè)細(xì)胞生長表面
  • 置入37培養(yǎng)箱3分種
  • 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶,使細(xì)胞脫落
  • 分別加入10毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
  • 移入一個(gè)50毫升錐形離心管
  • 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘,速度為200g
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx毫升預(yù)冷的  清理液(Reagent A)
  • 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘,速度為300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx毫升預(yù)冷的  裂解工作液
  • 渦旋震蕩5秒,充分混勻
  • 在冰槽里孵育2分鐘,期間渦旋震蕩5秒一次
  • 加入xx微升預(yù)冷的  強(qiáng)化液(Reagent D)
  • 渦旋震蕩5秒,充分混勻
  • 在冰槽里孵育5分鐘,期間渦旋震蕩5秒二次(注意:參見注意事項(xiàng)9
  • 加入xx毫升預(yù)冷的  保存液(Reagent E),輕輕搖動(dòng)試管混勻
  • 放進(jìn)4臺式離心機(jī)離心10分鐘,速度為1500g
  • 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
  • 放進(jìn)4超速離心機(jī)離心10分鐘,速度為12000g
  • 小心抽去上清液,保留沉淀顆粒 
  • 加入xx毫升預(yù)冷的  分離液(Reagent E),混勻
  • 置于冰槽里孵育15分鐘
  • 放進(jìn)4超速離心機(jī)離心15分鐘,速度為25000g
  • 小心抽去上清液,保留沉淀顆粒——此步驟獲得溶酶體沉淀物
  • (選擇步驟)加入xx毫升預(yù)冷的  保存液(Reagent F
  • (選擇步驟)放進(jìn)4超速離心機(jī)再次離心15分鐘,速度為25000g
  • (選擇步驟)小心抽去上清液
  • 加入xx微  保存液(Reagent F,充分混勻
  • 即刻移入1.5毫升離心管,放進(jìn)-70冰箱里

 

注意事項(xiàng)

 

  • 本產(chǎn)品為10次(1克動(dòng)物組織或 108細(xì)胞)操作
  • 所有操作均須嚴(yán)格在4或以下狀態(tài)進(jìn)行
  • 操作時(shí),須戴手套
  • 操作時(shí),須無菌操作,避免污染母液,尤其是  裂解液(Reagent B)  分離液(Reagent E
  • 建議使用足夠的樣品量
  • 建議嚴(yán)格控制操作時(shí)間
  • 通常勻化次數(shù)為20至40下(或細(xì)胞顆粒群/組織塊狀消失為止)達(dá)到80%的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài),但不同的組織或細(xì)胞類型會(huì)存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度:完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50%可以增加勻化次數(shù)
  • 通常孵育5分鐘(不宜超過5分鐘)達(dá)到80%的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài),但不同的組織或細(xì)胞類型會(huì)存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細(xì)胞裂解程度:完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50%可以增加孵育時(shí)間和渦旋震蕩次數(shù)
  • 對于難以裂解的細(xì)胞,例如HeLa細(xì)胞,采用物理勻漿法是優(yōu)先推薦的技術(shù)處理
  • 通常1克動(dòng)物組織或 108細(xì)胞的溶酶體含量為300微克左右溶酶體蛋白

11. 如果需要獲得99%以上純度的溶酶體,使用  細(xì)胞/組織高質(zhì)純化溶酶體分離試劑盒-GMS10118.3 

  • 溶酶體標(biāo)志酶活性測定,建議使用  通用型N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶NAG)活性比色法定量檢測試劑盒—GMS70031.1和  純化溶酶體酸性磷酸酶活性比色法定量檢測試劑盒—GMS50318.3 
  • 溶酶體形態(tài)和功能染色,建議使用  細(xì)胞溶酶體形態(tài)染色試劑盒—GMS10121和  純化溶酶體功能中性紅檢測試劑盒—GMS10323 
  • 本公司提供系列溶酶體分析試劑產(chǎn)品

 

 

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的溶酶體內(nèi)外膜完整
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的溶酶體維持正常活性
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶

 

免責(zé)聲明

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