真菌/酵母蛋白酶（PROTEASE）活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書

（中文版）

主要用途

  真菌/酵母蛋白酶（PROTEASE）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過底物酪蛋白受到蛋白酶水解，產生游離酪氨酸，與福林-酚反應，呈現藍色產物的吸光峰值的變化，即采用比色法來測定樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心改良、成功實驗證明的。其適用于各種細菌或酵母發酵產物以及上清樣品蛋白酶的總活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

蛋白酶（protease）又稱為肽酶（peptidase）或蛋白質酶（proteinase），是一類蛋白水解的酶，屬于水解酶（hydrolase）家屬中一員，存在于所有生物體內，共有560種不同的蛋白酶，通過易切斷（sciccile）肽鍵的水解，進行蛋白質的分解代謝，參與細胞繁殖分化、免疫反應、神經外展、血管生成、血液凝結、補體系統、凋亡等一系列生理活動，同時水解食物蛋白、活化蛋白功能、產生信號分子、破壞蛋白結構。一旦失調，與感染性疾病、心血管疾病、退行性疾病、癌癥等有關。蛋白酶基本分成6類，包括絲氨酸（serine）例如胰蛋白酶（trypsin）、糜蛋白酶（chymotrypsin）、凝血酶（thrombin）、纖溶酶（plasmin）、彈力蛋白酶（elastase）、枯草桿菌蛋白酶（Subtilisin）等；蘇氨酸（threonine）、半胱氨酸（cysteine）例如膠原蛋白酶（collagenase）、蛋白酶K（proteinase K）、木瓜蛋白酶（papain）、胃蛋白酶（pepsin）、菠蘿蛋白酶（bromelin）、無花果蛋白酶（ficin）、組織蛋白酶（cathepsin）等；谷氨酸（glutamate）、天冬氨酸（aspartate）、金屬（metalloprotease）蛋白酶等；也可以分成酸性（例如嗜熱菌蛋白酶Thermolysin）、中性和堿性蛋白酶等；還可以分成內切肽酶，例如胰蛋白酶（trypsin），和外切肽酶，例如羧基肽酶A（carboxypeptidase）。蛋白酶抑制劑成為抗病毒、凝血病、高血壓的治療藥物。 基于底物酪蛋白（casein），在蛋白酶的催化水解下，釋放出游離酪氨酸（tyrosine），繼而與福林-酚試劑（Folin & Ciocalteus phenol）反應產生藍色產物，通過其吸收峰值的變化（660nm波長），來定量分析蛋白酶的總活性。其反應系統為：

Protease

casein  +  H2O  →  tyrosine

tyrosin   +  Folin & Ciocalteus phenol   →  blue chromophore product

產品內容

  緩沖液（Reagent A）  50毫升

  底物液（Reagent B）  10毫升

  終止液（Reagent C）  50毫升

  中和液（Reagent D）     75毫升

  顯色液（Reagent E）       15毫升

  補充液（Reagent F）  10毫升

  標準液（Reagent G）     5毫升

產品說明書      1份

保存方式

保存在4℃冰箱里；  終止液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全；  顯色液（Reagent E），避免光照，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

2.2毫升離心管：用于標準品操作的容器

4℃（微型）臺式離心機：用于樣品處理

培養箱：用于反應物孵育

比色皿：用于比色測定的容器

分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

一、樣品準備

• 移取5毫升新鮮的發酵樣品到15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 分別移取上清液到預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用   Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、測定準備

• 從-70℃取出待測樣品，置于冰槽里
• 設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長為660nm，并置零 
•   緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

• 標準樣品測定

• 準備好5個2.2毫升離心管，標記為1至5號管
• 分別加入1毫升  緩沖液（Reagent A）到2至5號管
• 移取2毫升  標準液（Reagent G）到1號管
• 小心移取1毫升1號管的  標準液（Reagent G）到2號管，混勻
• 小心移取1毫升2號管稀釋的  標準液（Reagent G）到3號管，混勻
• 小心移取1毫升3號管稀釋的  標準液（Reagent G）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用；標準管濃度見下表

• 分別移取1毫升上述配制的系列  標準液（Reagent G）到15毫升錐形離心管
• 加入2.5毫升  中和液（Reagent D）
• 加入500微升  顯色液（Reagent E），混勻
• 37℃溫度下，孵育30分鐘
• 轉移到3毫升比色皿
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數
• 重復實驗步驟8至14四次
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光單位；橫座標（X軸）為標準酪氨酸濃度（毫摩爾/升）

• 樣品和背景測定

• 移取2毫升  緩沖液（Reagent A）到新的15毫升錐形離心管
• 加入500微升  底物液（Reagent B）
• 加入500微升待測樣品（100微克蛋白）或  補充液（Reagent F）
• 37℃溫度下，孵育10分鐘
• 分別加入2.5毫升  終止液（Reagent C），混勻
• 37℃溫度下，孵育30分鐘
• 移取1毫升上述反應產物到新的15毫升錐形離心管
• 加入2.5毫升  中和液（Reagent D）
• 加入500微升  顯色液（Reagent E），混勻
• 37℃溫度下，孵育30分鐘
• 轉移到3毫升比色皿
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數
• 實際樣品吸光讀數：樣品吸光讀數－背景吸光讀數
• 根據標準曲線獲得樣品對應酪氨酸濃度（毫摩爾/升）
• 測算樣品酶活性：

【根據標準曲線獲得樣品對應酪氨酸濃度（毫摩爾/升）X樣品稀釋倍數】÷10（反應時間；分鐘）＝微摩爾酪氨酸/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝微摩爾酪氨酸/毫克/分鐘

注意事項

• 本產品為25次操作，包括標準樣品測定
• 操作時，須戴手套
•   終止液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全
•   顯色液（Reagent E）注意避光
• 樣品檢測前，須溶解和澄清
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 測定值由低到高變化，表明有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/500微升；如果樣本酶活性過低，則可以增加樣本量（本公司提供   Bradford蛋白質濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 蛋白酶活性單位濃度定義：在37℃室溫下，pH 7.5的情況下，每單位酶在單位時間內（每分鐘）釋放1微摩爾的酪氨酸分子
• 本公司提供系列蛋白酶分析技術產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測準確