細胞γ分泌酶（γ-SECRETASE）活性熒光共振能量轉移法（FRET）定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

 細胞γ分泌酶（γ-SECRETASE）活性熒光共振能量轉移法（FRET）定量檢測試劑是一種旨在通過熒光探針NMA供體和DNP受體雙重標記的多肽底物，在γ分泌酶的水解作用下，釋放出強烈熒光的NMA，而發生熒光峰值的變化，即采用熒光共振能量轉移法來測定樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或*純化酶樣品中γ分泌酶活性的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，安全可靠。

技術背景

γ分泌酶（γ-SECRETASE；EC3.4.24.81），是一種多亞體蛋白酶復合物（multisubunit protease complex），由4種蛋白組成：早老素蛋白（Presenilin；PS）、呆蛋白（nicastrin）、前咽缺陷蛋白-1（anterior pharynx defective 1；APH1）和早老素增強蛋白2（presenilin enhancer 2）。其為整合性跨膜蛋白，在早期內質網里組裝和成熟，后期內質網進行目標蛋白切離。γ分泌酶切離由β分泌酶切離淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein；APP）產生C99和α分泌酶切離的C83片段，前者成為具有神經毒性的40至42氨基酸長的淀粉樣β-多肽（amyloid-β peptide；Aβ）， 是阿茨罕默疾病（alzheimer disease；AD）的病理變化（淀粉樣斑；amyloid plaque）的主要成分，由此γ分泌酶成為阿茨罕默疾病治療的抗淀粉樣多肽藥物靶標。γ分泌酶與NOTCH調節有關。 基于底物多肽Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr-Val（源于淀粉樣淀粉樣β-多肽前體蛋白序列708-715），通過熒光共振能量轉移法（Fluorescence resonance energy transfer；FRET），即傳遞激發狀態的能量由處于較短波長的供體（donor）到覆蓋供體波長的受體（acceptor），使得距離依賴性反應的供體的散發光子淬滅（quench），使用2個熒光探針N-甲基氨茴酰NMA（N-Methyl-anthraniloyl）供體和二硝基苯基DNP（2,4-Dinitrophenyl）受體作為FRET對，來標記的γ分泌酶選擇性多肽底物的兩端，在γ分泌酶的水解作用下，在丙氨酰（alaninyl）和蘇氨酰（threoninyl）殘基處切離，釋放出強烈熒光的NMA，在熒光分光光度儀下（激發波長340-360nm，散發波長440-450nm），來定量測定γ分泌酶的活性。其反應系統為：

產品內容

 清理液（Reagent A） 毫升 裂解液（Reagent B） 毫升 緩沖液（Reagent C） 毫升 底物液（Reagent D） 微升 標準液（Reagent E）      微升

產品說明書    1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里； 底物液（Reagent D）和 標準液（Reagent E）避免光照，有效保證6月

用戶自備

γ分泌酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于標準樣品操作和樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于細胞預處理

黑色酶標板：用于反應和比色的容器

熒光酶標儀：用于熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

一、樣品準備

• 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入xx毫升 清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升 裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

• 測定準備

• 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液或純化酶樣品等），置于冰槽里
• 設定好熒光酶標儀（溫度為37℃）：激發波長355nm，散發波長440nm，間隔10分鐘，讀數7次（共60分鐘） 
• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 加入xx微升 緩沖液（Reagent C）到1號管
• 分別加入xx微升 緩沖液（Reagent C）到2至5號管
• 移取xx微升 標準液（Reagent E）到1號管，混勻
• 小心移取xx微升1號管稀釋的 標準液（Reagent E）到2號管，混勻
• 小心移取xx微升2號管稀釋的 標準液（Reagent E）到3號管，混勻
• 小心移取xx微升3號管稀釋的 標準液（Reagent E）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用；標準管濃度見下表

三、熒光測定

（一）活性測定

• 在96孔酶標板上做好相應標記：標準樣品和待測樣品
• 分別移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到相應孔中
• 分別加入xx微升 底物液（Reagent D）
• 分別加入20微升上述配制的標準液或待測樣品（20微克純化酶或100微克細胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔酶標板
• 即刻放進熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光讀數RFU（Relative Fluorescence Unit）
• 活性計算：

（二）活性抑制測定（抑制劑篩選）

• 在96孔酶標板上做好相應標記：背景、零抑制、*抑制和待測抑制劑樣品
• 按下表加入試劑

• 輕輕搖動96孔酶標板
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 即刻放進熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光讀數RFU（Relative Fluorescence Unit）
• 抑制活性計算：

注意事項

• 本產品為25次操作，包括標準液
• 建議使用膜蛋白樣品為佳（推薦使用 細胞可溶性膜蛋白（粗提）制備試劑盒—GMS30039.1
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，標準液測定只需1次
• 樣品須澄清，至關重要
• 孵育反應完成后即刻進行熒光測定
• 熒光濾波器可以使用激發波長在340-360nm，散發波長440-450nm
• 待測樣本為粗提酶樣品，其蛋白濃度為20微克/20微升；膜蛋白樣品，為50微克/20微升；細胞裂解懸液，為100微克/20微升（本公司提供   Bradford蛋白質濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 相對熒光讀數RFU（Relative Fluorescence Unit）越高，表明酶活性越高
• 用戶可以使用γ分泌酶抑制劑L685,458（IC50=17納摩爾）作為抑制劑對照或陰性對照
• γ分泌酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 6.8條件下，每分鐘內能夠水解釋放1納摩爾熒光產物NMA所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列蛋白酶檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感