細胞培養(yǎng)真菌污染定性熒光檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

 細胞培養(yǎng)真菌污染定性熒光檢測試劑盒是一種旨在通過特異性真菌細胞壁結合熒光染料使活體真菌立刻染色，呈現(xiàn)絲狀體狀藍色熒光的而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種人體和動物細胞培養(yǎng)中真菌（霉菌）污染的定性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，性能穩(wěn)定，檢測敏感，熒光清晰。

技術背景

細胞培養(yǎng)中的主要微生物污染包括支原體（mycoplasma）、細菌、真菌、酵母和病毒等。在含有抗生素的培養(yǎng)液中，低水平的真菌菌污染則難以觀察和發(fā)現(xiàn)。Fluorescence brightener 28，又稱為Calcofluor White M2R， 為一種特異性結合真菌細胞壁上纖維素（cellulose）和甲殼素（chitin），且紫外激發(fā)的藍色熒光染料，其分子式為C₄₀H₄₄N₁₂O₁₀S₂，分子量916.98。一旦結合真菌細胞壁，呈現(xiàn)強力的藍色熒光。細胞培養(yǎng)真菌污染定性熒光染色技術，通過Fluorescence brightener 28對真菌菌胞壁的染色，具有快速檢測細胞培養(yǎng)中真菌的存在，在熒光顯微鏡下（激發(fā)波長365nm，散發(fā)波長425nm）下觀察到藍色絲狀體。

產(chǎn)品內容

 清理液（Reagent A）   毫升

 染色液（Reagent B） 微升

 堿性液（Reagent C） 微升

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存在-20℃冰箱里，避免光照； 堿性液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

載玻片和蓋玻片：用于樣品染色的載體

臺式離心機：用于懸浮細胞操作

細胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿：用于培養(yǎng)細胞的容器

實驗步驟

• 貼壁細胞培養(yǎng)檢測

• 準備好待測細胞培養(yǎng)至50％鋪滿率 
• 小心移取5毫升細胞培養(yǎng)容器里的培養(yǎng)液到15毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心15分鐘，速度為1000g
• 小心抽掉上清液
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放進臺式離心機離心15分鐘，速度為1000g
• 小心抽掉上清液
• 加入xx微升 清理液（Reagent A），混勻
• 移取20微升混勻液到潔凈的載玻片上
• 放進37℃培養(yǎng)箱孵育10分鐘，使其晾干
• 快速在酒精燈火上加熱固定（注意：切忌過熱處理）
• 加上xx微升 清理液（Reagent A）在載玻片上，覆蓋樣品
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心抽去清理液
• 加上xx微升 染色液（Reagent B）在載玻片上
• （選擇步驟）加上xx微升 堿性液（Reagent C）（注意：如果需要觀察真菌結構成分）
• 蓋上蓋玻片
• 在室溫下，暗室里孵育5分鐘 
• （選擇步驟）移去蓋玻片，小心抽去染色液
• （選擇步驟）小心加上xx微升 清理液（Reagent A）在載玻片上，覆蓋樣品
• （選擇步驟）小心抽去清理液
• 封片處理
• 置于熒光顯微鏡下觀察染（100至400倍放大倍數(shù)）：激發(fā)波長365nm，散發(fā)波長425nm（類同DAPI濾波器）

真菌呈現(xiàn)絲狀體藍色熒光

二、懸浮細胞培養(yǎng)檢測

• 將待測懸浮細胞（1 X 10⁵總量）移入到15毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心15分鐘，速度為1000g 
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升 清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 移取20微升混勻液到潔凈的載玻片上
• 放進37℃培養(yǎng)箱孵育10分鐘，使其晾干
• 快速在酒精燈火上加熱固定（注意：切忌過熱處理）
• 加上xx微升 清理液（Reagent A）在載玻片上，覆蓋樣品
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心抽去清理液
• 加上xx微升 染色液（Reagent B）在載玻片上
• （選擇步驟）加上xx微升 堿性液（Reagent C）（注意：如果需要觀察真菌結構成分）
• 蓋上蓋玻片
• 在室溫下，暗室里孵育5分鐘 
• （選擇步驟）移去蓋玻片，小心抽去染色液
• （選擇步驟）小心加上xx微升 清理液（Reagent A）在載玻片上，覆蓋樣品
• （選擇步驟）小心抽去清理液
• 封片處理
• 置于熒光顯微鏡下觀察染（100至400倍放大倍數(shù)）：激發(fā)波長365nm，散發(fā)波長425nm（類同DAPI濾波器）

真菌呈現(xiàn)絲狀體藍色熒光

 注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 本產(chǎn)品可以檢測各種真菌菌株，例如Alternaria alternata、Stemphylium botryosum、Cladosporium herbarum、Geotrichum candidum、 P. parasitica、Pyt. Aniderphermatum、Pyt. Ultimum、Fusarium oxysporum、Rhizopus stolonifer、Botrytis cinerea等
• 操作時須戴手套
• 操作時，嚴格無菌操作
•  堿性液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全
• 染色時，避免光照
• 細胞染色前后的清洗過程中，小心操作
• 如果有酵母污染，可見較大的球體或橢球體（elliposoid）、發(fā)芽體藍色熒光
• 如果為細胞碎片，通常可見不規(guī)則染色
• 本公司提供系列細胞培養(yǎng)污染檢測試劑產(chǎn)品

質量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰