檢測方法

利用酶聯免疫吸附測定法用食品及飼料中三聚氰胺的定量測定。

檢測原理

酶聯免疫吸附測定法定量測定三聚氰胺殘留。利用萃取液通過均質及振蕩的方式提取樣品中的三聚氰胺進行免疫測定。先將三聚氰胺酶標記物，樣品萃取物及標準加入到已經包被有三聚氰胺抗體的微孔中開始反應。在30分鐘的孵育過程中，樣品萃取物中的三聚氰胺與三聚氰胺酶標記物競爭結合微孔中的三聚氰胺抗體，孵育30分鐘后洗掉小孔中所有沒有結合的三聚氰胺及三聚氰胺酶標記物。在用去離子水清洗結束后，每孔中加入清澈的底物溶液，結合的酶標記物將無色的底物轉化為藍色的物質。孵育30分鐘后停止此反應，根據各孔顏色深淺進行數據讀取。依據標準的顏色得出樣品中三聚氰胺的的濃度值。

實驗所需設備及材料

三聚氰胺檢測試劑盒（目前常用進口試劑有美國Abraxis公司和美國Beacon公司的）
酶標儀一臺（配有450nm濾光片）
1－5ml可調移液器
100－1000ul可調移液器.
20－200ul可調移液器.

蒸餾水或去離子水..
可吸取50ul的移液器及吸頭.
可吸取50ul和100ul的八道移液器及吸頭.
吸水紙或相當的吸水材料.
450nm的酶標儀.
計時器.
洗瓶
混旋器.
20mM PBS： 0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl ,蒸餾水定容至1000ml.


注意事項
配套使用試劑，不要同其它公司的產品混用，不要將不同批次的產品混用。
樣品稀釋或含有雜質很可能對結果的準確性有影響。
不要使用過期的產品。
使用之前將所有試劑回升至室溫，但不要放置超過24小時。
三聚氰胺屬于有毒性的化學品，請小心處理。
停止液是1N鹽酸，避免接觸皮膚。 

樣品制備 （以美國Beacon試劑為例）
濕的寵物食品萃取方法（稀釋倍數：100）
均質樣品至布丁狀。
稱取2g樣品加入10mL 60%甲醇/水溶液，并劇烈振蕩。
超聲萃取1分鐘。
漩渦混合1分鐘，然后靜置5分鐘，使樣品分層。
3000 g 室溫離心5分鐘。
用玻璃纖維濾紙過濾上清液，并將萃取液收集于一干凈試管中。
用樣品稀釋液將濾液20倍稀釋（如：0.1mL濾液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS）
移取150 ul 進行分析。
注意：用此方法測定了8個添加有15ppm三聚氰胺的貓糧（非要求召回），回收率范圍為75%-117%。
本方法只可作為樣品篩選方法，不可作為zui終確認方法。

小麥面筋蛋白萃取方法：（稀釋倍數：500）
1.均質或混勻小麥面筋蛋白樣品。
2.稱取0.2g均質好的樣品加入10mL 酸化的60%甲醇/水溶液（1mL 1N HCl/ 100mL 60%甲醇/水）。
3.漩渦混合并超聲萃取，使樣品溶解（確保樣品中沒有結塊）。
4.用樣品稀釋液稀釋萃取液按照1:10比例。（0.5mL+4.5mL 10%MeOH/20 mM PBS）。
5.10000轉/分離心上清液10分鐘。
6.用G6玻璃纖維濾紙過濾上清液，并將萃取液收集于一干凈試管中。
7.移取150 ul 進行分析。

注意：如果樣品中含有大量的添加物，需要加入更大量的萃取溶液，以保證萃取效率。
操作人依據自己的判斷力，如果測試結果比較高，需要加入兩倍的萃取溶液（0.2/20mL），進行二次測定。

干的寵物食品萃取方法（稀釋倍數：200）
1.質器均質干的寵物飼料樣品。
2.稱取1g樣品加入10mL 60%甲醇/水溶液，并劇烈振蕩。
3.超聲萃取1分鐘。漩渦混合1分鐘，然后靜置5分鐘，使樣品分層。
4.3000 g 室溫離心5分鐘。
5.用G6玻璃纖維濾紙過濾上清液，并將萃取液收集于一干凈試管中。
6.用樣品稀釋液將濾液20倍稀釋（如：0.1mL濾液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS）
7.移取150 ul 進行分析。

免疫測定過程 （注意: 標準及樣品做平行試驗以增加準確度）
將所有試劑及樣品回升至室溫20-280C，但不要放置超過24小時。
從鋁箔袋中拿出要求數量的微孔條，放入干燥劑并重新封好袋子以免微孔條受潮
吸取150ul標準、樣品到對應微孔中，必須保證每種溶液使用干凈的吸頭吸取，避免交叉污染。 加入50ul三聚氰胺酶標記溶液到每個小孔中。
混合60秒，20-28攝氏度下孵育30分鐘。
將微孔中的溶液倒入水槽中，用蒸餾水*充滿微孔，震蕩后倒掉，重復三次，總共四次洗板。
在吸水紙上拍打，盡可能將水拍干。
每個微孔中加入100ul底物溶液。
20-28攝氏度下，孵育30分鐘。
每個微孔中加入100ul停止液。
450nm下讀板。

結果分析
半定量的結果是由樣品的吸光率與標準的吸光率的簡單對比而來判定:樣品的顏色比標準的顏色淺則三聚氰胺的濃度比標準樣的濃度高, 樣品的顏色比標準的顏色深則三聚氰胺的濃度比標準樣的濃度低。
定量分析需要繪制以標準樣的吸光率為X軸,以標準樣的濃度的半對數為Y軸的曲線圖.依據標準樣吸光率的點畫成一直線,如此樣品的光吸收率可在線上找到,與此相對應的Y軸則為樣品的濃度,樣品光吸收率范圍應比標準樣的zui底范圍高,比zui高范圍低, 即可說明此樣品中三聚氰胺的含量大于500ppb或小于20ppb。