ELISA免疫符號(hào)技能試驗(yàn)原理

ELISA免疫符號(hào)技能試驗(yàn)原理
免疫符號(hào)技能是將一些既易測(cè)定又具有高度敏感性的物質(zhì)符號(hào)到特異性抗原或抗體分子上，經(jīng)過這些符號(hào)物的增強(qiáng)擴(kuò)大效應(yīng)來顯現(xiàn)反響體系中抗原或抗體的性質(zhì)與含量。常用的符號(hào)物包含熒光素、酶和放射性核素等，用這3種符號(hào)物進(jìn)行符號(hào)的免疫檢測(cè)技能被稱為3大免疫符號(hào)技能?，F(xiàn)在，使用的免疫符號(hào)物還有化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、鐵蛋白和膠體金等。

辣根過氧化物酶(HorserADIsh Peroxidase, HRP)
辣根過氧化物酶 (horse radish peroxidase，簡(jiǎn)稱HRP，EC.1.11.1.7)是植物中研討得zui深入的一種過氧化物酶，早在20世紀(jì)30年代就有人著手從辣根中別離此酶，以后又制備出結(jié)晶。本試驗(yàn)是以辣根為質(zhì)料，經(jīng)過水的抽提，硫酸銨和丙酮分級(jí)別離，再經(jīng)鋅離子純化，透析除鹽，冰凍枯燥，便可得到高純度的辣根過氧化物酶。

辣根過氧化物酶是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì)，HRP廣泛散布于植物界，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個(gè)同功酶構(gòu)成，Mr在40000左右，等電點(diǎn)7.2。溶于水，溶解度為5%(W/V)，溶液呈棕赤色，通明。酶催化的zui適PH因供氫體不一樣而稍有區(qū)別，但多在pH5左右。酶溶于水和58%以下的硫酸銨溶液。HRP可溶于0.58飽和度以下的硫酸銨溶液，而0.62飽和度以上則不溶。該酶zui適pH7.0(對(duì)愈創(chuàng)木酚為氫給體而言)。

在室溫下，HRP幾周內(nèi)安穩(wěn)，加熱到63℃，在15min內(nèi)安穩(wěn)。氧化還原電勢(shì)很低，pH6.08時(shí)，E 0 =-0.2070V，pH為7.71時(shí)，E′0 =-0.2787V。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為403nm和275nm，通常以O(shè)D403nm/OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表明酶的純度。* ?# p. n2 ~1 w. X3 b

酶符號(hào)物包含酶符號(hào)抗原、酶符號(hào)抗體和酶符號(hào)SPA等。酶符號(hào)物質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到免疫酶技能的成功與否，因而被稱為要害的試劑。酶符號(hào)物中zui常用的是酶符號(hào)抗體，它是將酶與特異性抗體經(jīng)恰當(dāng)辦法銜接而成。酶符號(hào)抗體的質(zhì)量首要取決于純度好、活性強(qiáng)及親和力高的酶和抗體，其次要有杰出的制備辦法?，F(xiàn)在，高質(zhì)量的酶(如辣根過氧化物酶，簡(jiǎn)稱HRP)國(guó)內(nèi)已有產(chǎn)品供應(yīng)。高質(zhì)量的抗體則可經(jīng)過獲取純化而取得。在制備辦法上，宜選用產(chǎn)率高、不影響物的活性和不稠濁攪擾性物質(zhì)且操作簡(jiǎn)便易行的辦法。