一，C57小鼠BMSCs原代培養

    1，實驗前準備好相關手術器械，培養器材及相關試劑PBS平衡緩沖液、10％FBS，IMDM培養基。

    2，脫頸法處死C57小鼠，在75％乙醇中浸泡5min，轉移至超凈工作臺中，無菌條件下分離出小鼠的長骨(股骨和脛骨)，浸泡于PBS溶液中。

3，對股骨和脛骨進行深層次解剖，去除附著的肌肉組織，剪掉長骨兩端的干骺端，用10％FBS，IMDM培養基反復沖洗骨髓腔，直至骨髓腔發白，收集洗滌液，用移液槍輕輕吹散分離為單個細胞。

4，細胞接種于六孔板中培養，輕微搖勻，使細胞在孔中均勻分布，放置于37℃、5％CO2培養箱中靜置培養，培養期間不要移動六孔板，使BMSCs充分貼壁。

5，培養48h后換液，用預熱的PBS緩沖液輕輕洗滌細胞2次，添加新鮮培養基，之后每隔48h換液1次。原代培養6-7d后細胞鋪滿80％(圖1)，可進行傳代培養。

            圖1：BMSCs原代培養6-7d (武漢云克隆診斷試劑研究所)

二，BMSCs成脂誘導分化

BMSCs鋪皿，細胞融合達80％以上后，棄去原培養基，添加成脂誘導培養基(IMDM中加入10%FBS，10μg/ml胰島素，1μM地塞米松，0.5mMIBMX，0.1mM吲哚美辛)。3d換液1次， 分化12d。

待脂滴形成后進行油紅O染色，PBS緩沖液清洗3次，10％中性甲醛固定20min，再用PBS緩沖液清洗2次，油紅O染液浸染30min，PBS緩沖液清洗2次，蘇木素染液浸染1min，棄去染液，倒置顯微鏡下觀察拍照。

成脂誘導分化過程中發現在誘導5d時，細胞形態開始變圓并大量脫落，部分細胞中出現細小脂滴(圖2)。

                        圖2：BMSCs成脂誘導5d

三，BMSCs成骨誘導分化

BMSCs鋪皿，細胞融合達80％以上后，棄去原培養基，添加成骨誘導培養基(IMDM中加入10%FBS,5μg/ml胰島素，0.1μM地塞米松，0.2mM維生素C和10mM β-甘油磷酸鹽)。3d換液1次，分化15d(圖3)。

待礦化結節形成后，進行硝酸銀染色。PBS緩沖液清洗3次，10％中性甲醛固定20min，再用PBS緩沖液清洗2次，硝酸銀染液浸染，于陽光下曝光30min，PBS緩沖液清洗2次，倒置顯微鏡下觀察拍照，可見礦化結節(圖4)。

圖3：BMSCs成骨誘導分化6d

 圖4：BMSCs成骨誘導形成礦化結節