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第三節 細胞的凍存與復蘇

為了防止因污染或技術原因使長期培養功虧一簣，考慮到培養細胞因傳代而遲早會出現變異，有時因寄贈、交換和購買，培養細胞從一個實驗室轉運到另一個實驗室，*的策略是進行低溫保存。這對于維持一些特殊細胞株的遺傳特性極為重要。現簡要介紹深低溫保存法(－70℃~－196℃)的特點。細胞深低溫保存的基本原理是：在－70℃以下時，細胞內的酶活性均己停止，即代謝處于*停止狀態，故可以長期保存。細胞低溫保存的關鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內，水晶呈針狀，極易招致細胞的嚴重損傷。

一、細胞的凍存：為避免污染造成的損失，zui小化連續細胞系的遺傳改變和避免有限細胞系的老化和轉化，需要凍存哺乳細胞。凍存細胞前，細胞應該特性化并檢查是否污染。

有幾種普通培養基用來凍存細胞。對于包含有血清的培養基，成分可能如下：

包含10％甘油的*培養基，

包含10％二甲基亞砜（DMSO）的*培養基，

50％ 細胞條件培養基和50％含有10％甘油的新鮮培養基，或

50％ 細胞條件培養基和50％含有10％二甲基亞砜的新鮮培養基。

對于無血清培養基，一些普通的培養基成分可能是：

50％ 細胞條件無血清培養基和50％包含有7.5％二甲基亞砜的新鮮的無血清培養基，或

包含有7.5％二甲基亞砜和10％細胞培養級BSA的新鮮無血清培養基。人Burkitt’s淋巴瘤細胞培養技術

1、懸浮細胞

計數將要凍存的活細胞。細胞應該處于對數生長期。以大約200～400g離心5分鐘沉淀細胞，使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細胞。

以1×10⁷到5×10⁷細胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培養基中再次懸浮細胞，或者以0.5×10⁷到1×10²⁷在無血清培養基中，再次懸浮細胞。

分裝進凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內開始冷凍步驟。

細胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉移到液氮中貯存。

2、貼壁細胞

使用分離試劑從基層分離細胞，分離時盡可能溫和，使對細胞的損傷減少到zui小。

在*生長培養基中，再次懸浮分離細胞，確定有活力細胞數。

以大約200g離心5分鐘沉淀細胞。使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細胞。

以5×10⁶到1×10⁶細胞/ml密度，在凍存液中懸浮細胞。

分裝進凍存管，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內開始冷凍步驟。

細胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉移到液氮中貯存。

二、凍存細胞的復蘇:凍存細胞較脆弱，要輕柔操作。凍存細胞要快速融化，并直接加入*生長培養基中。若細胞對凍存劑（DMSO或甘油）敏感，離心去除凍存培養基，然后加入*生長培養基中。

1、直接鋪板方法

取出貯存細胞，37℃水浴中快速融化。

直接用*生長培養基鋪板細胞。1ml凍存細胞使用10~20ml*生長培養基。進行活細胞計數，細胞接種應該至少在3×10⁵活細胞/ml。培養細胞12到24小時，更換新鮮的*生長培養基，去除凍存劑。

2、離心方法

取出貯存細胞，37℃水浴中快速融化。

把1到2ml凍存細胞加入到大約25ml*生長培養基，輕輕混勻。

以大約80x g離心2到3分鐘。

棄去上清。

在*生長培養基輕輕再次懸浮細胞，并且進行活細胞計數。

細胞鋪板，細胞接種應該至少為3×105活細胞/ml。

三、細胞的分化、衰老與死亡

1、細胞的分化:一個成年人全身細胞總數約1012個，可以區分為200多種不同類型的細胞：形態結構，代謝，行為，功能等各不相同。追根溯源，這么多種細胞均來自一個受精卵細胞。所以，通常把發育過程中，細胞后代在形態、結構和功能上發生差異的過程稱為細胞分化。細胞分化發生在胚胎階段，也發生在胎兒出生以后，乃至成人階段。例如，人體血細胞的產生和分化，這個過程在人的一生中一直持續著。

由旺盛生長不斷分裂的細胞，轉入分化，通常從細胞周期中G1期開始時一個確定的點G0點“逃逸”出細胞周期。旺盛生長分裂的細胞和各種分化了的細胞，它們的基因表達和代謝活動各不相同。

2、細胞的衰老:體外細胞培養實驗證明：

成纖維細胞：來自胎兒傳代50次后衰老死亡,來自成人傳代20次后衰老死亡(與具體年齡有關);來自小鼠傳代14--28次后衰老死亡,來自烏龜傳代90--125次后衰老死亡。

細胞衰老過程中會發生一系列的變化，包括：蛋白質合成速度降低，已有蛋白質結構變化，特異蛋白質成份出現；同時，細胞核，線粒體，膜系統、骨架系統等都有結構、功能的改變。

細胞衰老原因，尚無定論，出現過好幾種理論與假說，其中得到較廣泛認可的是“自由基損傷假說”。

3、細胞凋亡:細胞的死亡是個體存活的正常現象，常見的細胞死亡形式有3種：壞死、凋亡和細胞毒性。多細胞生物的生命活動中，因為環境因素的突然變化或病原物的入侵，導致一部分細胞死，稱為細胞的病理死亡，或細胞壞死。壞死是細胞暴露于嚴重的物理或化學刺激時導致的細胞死亡；細胞毒性是由細胞或者化學物質引起的單純的細胞殺傷事件，不依賴于其它兩種細胞死亡機理，如殺傷T細胞的細胞毒性作用。人Burkitt’s淋巴瘤細胞培養技術

HCT-15細胞，人結腸癌細胞

HT-29細胞，人結腸癌細胞

SW480細胞，人結腸癌細胞

SW620細胞，人結腸癌細胞

RKO-AS45-1細胞，人結腸癌轉基因細胞

RKO-E6細胞，人結腸癌轉基因細胞

DLD-1細胞，人結腸腺癌細胞

LoVo細胞，人結腸腺癌細胞

LS 174T細胞，人結腸腺癌細胞

LS 180細胞，人結腸腺癌細胞

Ls-174-T細胞，人結腸腺癌細胞

RKO細胞，人結腸腺癌細胞

SW1116細胞，人結腸腺癌細胞

SW48細胞，人結腸腺癌細胞

T84細胞，人結腸腺癌肺轉移細胞

HRT-18細胞，人結直腸癌細胞

Caco-2細胞，人結直腸腺癌細胞

COLO 201細胞，人結直腸腺癌細胞

NCI-H716細胞，人結直腸腺癌細胞

SK-CO-1細胞，人結直腸腺癌細胞

SW837細胞，人結直腸腺癌上皮細胞

Dami細胞，人巨核白血病細胞

還有一種情況，一部分細胞的死亡是生物個體正

常生命活動（代謝、生長、發育、分化）的一個必要部分；似乎帶有“犧牲局部，保全整體”的意味。這種情況下的細胞死亡，明顯地受遺傳控制，稱為細胞凋亡。 凋亡（Apoptosis）則是程序性的、正常的細胞死亡，是機體清除無用的或者不想要的細胞的手段。它與細胞壞死是兩個截然不同的過程，無論從形態學、生物學還是生化的特征來說，都有明顯的區別。細胞凋亡現象普遍存在于生物界。細胞凋亡與細胞增殖、分化和衰老起著互補與平衡的作用，在多細胞動物的發育、形態建成與維持中扮演至關重要的角色。作為細胞的一種基本生命現象，凋亡失控的結果將是可怕的：凋亡不足時，易發生癌變、病毒性疾病和自身免疫疾病；而凋亡過量則可能產生獲得性免疫缺陷綜合征（HIV）、重癥肝炎與退行性神經疾病，如老年性癡呆癥（Alzheimer's disease）、帕金森氏癥（Parkinson's disease）。因此研究細胞凋亡及其機理具有重要的理論和實踐意義。

細胞凋亡與壞死的區別

壞死 ：

形態學特征-膜完整性喪失，胞漿和線粒體膨脹，全細胞裂解。

生化特征-離子內環境失調：非能量依賴性的（被動過程，在4°C也可以發生），隨機消化DNA（電泳顯示為DNA彌散狀態），Postlytic DNA斷裂。

生理學特征-影響群組細胞：由非生理學因素引起（如補體攻擊、代謝中毒、缺氧等），被巨噬細胞吞噬，周圍有明顯的炎癥反應。

凋亡 ：

形態學特征-胞膜出芽，但保持完整，染色體聚集在核膜周邊，胞漿收縮、細胞核凝集，zui后細胞分裂為凋亡小體，Bcl-2家族蛋白導致線粒體膜通透性增加。

生化特征--ATP依賴性的（主動過程，在4°C不能發生），以核小體為單位剪切DNA（電泳顯示為DNA ladder），Prelytic DNA 斷裂,線粒體釋放多種因子至胞漿中（細胞色素c、AIF），Caspases級聯活化，膜對稱性改變（PS外翻）

生理學特征--只影響單個細胞，由生理學刺激誘導（如生長因子缺乏、激素環境改變等），被臨近細胞和巨噬細胞吞噬，無炎癥反應。人Burkitt’s淋巴瘤細胞培養技術