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在正相色譜中，一般采用極性鍵合固定相，硅膠表面鍵合的是極性的有機基團，鍵合相的名稱由鍵合上去的基團而定。常用的有氰基（-CN）、氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）鍵合相。流動相一般用比鍵合相極性小的非極性或弱極性有機溶劑，如烴類溶劑，或其中加入一定量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等），以調節流動相的洗脫強度。通常用于分離極性化合物。一般認為正相色譜的分離機制屬于分配色譜。組分的分配比K值，隨其極性的增加而增大，但隨流動相中極性調節劑的極性增大（或濃度增大）而降低。同時，極性鍵合相的極性越大，組分的保留值越大。該法主要用于分離異構體，極性不同的化合物，特別是用來分離不同類型的化合物。
在反相色譜中，一般采用非極性鍵合固定相，如硅膠-C18H37（簡稱ODS或C18）硅膠-苯基等，用強極性的溶劑為流動相，如甲醇/水，乙腈/水，水和無機鹽的緩沖液等。
正相色譜和反相色譜的區別：
正相色譜和反相色譜的區別：
本質上是填料(固定相)的不同,正相色譜柱填料極性強,洗脫順序由弱到強；反相色譜柱填料極性弱，洗脫順序由強到弱。
1、正相色譜
正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica）以及其他具有極性官能團胺基團，如（NH2，APS）和氰基團（CN，CPS）的鍵合相填料。 由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他極性基團極性較強，因此，分離的次序是依據樣品中各組分的極性大小，即極性較弱的組份先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如正已烷（Hexane），氯仿（Chloroform），二氯甲烷（Methylene Chloride）等。
2、反相色譜
反相色譜用的填料常是以硅膠為基質，表面鍵合有極性相對較弱官能團的鍵合相。反相色譜所使用的流動相極性較強，通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強的組分先被沖洗出，而極性弱的組分會在色譜柱上有更強的保留。
常用的反相填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。
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