| 供貨周期 |
一個月 |
應用領域 |
化工,生物產業,制藥/生物制藥 |
人可溶性腫瘤壞死因子-1試劑盒，借雙抗夾心 ELISA 法測樣本中 sTNF-1。從樣本準備到結果測定，各環節嚴謹規范，多要點保障檢測精準 。
人可溶性腫瘤壞死因子-1試劑盒
人可溶性腫瘤壞死因子-1試劑盒在醫學研究與臨床診斷中發揮著重要作用，主要用于精準檢測人血清、血漿、細胞培養上清液等樣本中可溶性腫瘤壞死因子 - 1（sTNF-1）的含量 。通過對 sTNF-1 含量的測定，能為探究炎癥反應、免疫調節以及相關疾病的發病機制提供關鍵依據 。
一、檢測原理
該試劑盒通常采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗（ELISA）原理 。在試劑盒所配備的酶標板孔內，預先包被有針對人 sTNF-1 的特異性捕獲抗體 。當進行檢測時，將標準品與經過妥善處理的待測樣本依次加入酶標板孔中 。樣本中的 sTNF-1 會迅速與包被在孔壁上的捕獲抗體特異性結合 。經過一段適宜時間的溫育，確保結合反應充分進行后，通過洗滌操作去除未結合的雜質以及其他干擾成分 。隨后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體 。該酶標抗體能夠與已經結合在捕獲抗體上的 sTNF-1 再次特異性結合，從而形成 “捕獲抗體 - sTNF-1 - 酶標檢測抗體" 的穩固免疫復合物 。再次進行洗滌，以徹di清除未參與反應的多余酶標檢測抗體 。緊接著，向各孔中添加底物 TMB 。在 HRP 的高效催化作用下，原本無色的 TMB 底物發生化學反應，逐步轉變為藍色產物 。反應持續一段時間后，加入終止液，使反應迅速停止，此時溶液顏色由藍色轉變為黃色 。由于溶液顏色的深淺程度與樣本中 sTNF-1 的含量呈正相關關系，借助酶標儀在 450nm 波長下測量各孔溶液的吸光度（OD 值），并依據標準品的 OD 值繪制出精準的標準曲線，即可精確推算出待測樣本中 sTNF-1 的濃度 。
二、操作步驟
樣本準備：血清樣本采集后，需在 1000×g 的條件下離心 10 分鐘，小心分離出血清；血漿樣本同樣按此離心條件處理，注意要依據不同抗凝劑要求規范采集；細胞培養上清液則需以 1000×g 離心 10 分鐘，去除其中的細胞碎片和其他不溶性雜質 。若樣本不立即使用，應分成小份，在 - 20℃或 -80℃環境下保存，防止反復凍融，使用前需在室溫下緩慢充分解凍并確保均勻 。
試劑準備：從冰箱取出試劑盒后，需將所有試劑在室溫下平衡 30 - 60 分鐘，使試劑溫度與室溫一致，并充分混勻 。同時，依據實驗所需檢測的樣本數量，確定酶標板的使用條數，標準品孔和空白孔建議設置復孔，以提高檢測結果的準確性與可靠性 。此外，要按照說明書要求，用蒸餾水將濃縮洗滌液準確稀釋成工作洗滌液 。
加樣：在酶標板上精確設置標準品孔、空白孔與待測樣本孔 。向標準品孔中加入 50μL 已稀釋好的不同濃度標準品，濃度梯度需嚴格按照試劑盒說明書進行配置；待測樣本孔加入 50μL 處理好的樣本；空白孔則不加任何試劑 。加樣時，務必使用微量加樣器，并確保加樣量準確，將樣本或標準品加于酶標板孔底部，盡量避免觸及孔壁，加樣后輕輕振蕩酶標板，使液體充分混勻 。
溫育與洗滌：加樣完成后，用封板膜將酶標板密封，放置在 37℃恒溫培養箱中溫育相應時間，具體溫育時長參照試劑盒說明書 。溫育結束后，小心揭去封板膜，甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩 30 - 60 秒后，甩去洗滌液，并用吸水紙拍干，此洗滌操作需重復 4 - 5 次，以確保充分去除未結合物質 。若使用洗板機進行洗滌，需提前按照儀器操作規程進行設置，且洗滌次數應適當增加 1 - 2 次 。
后續反應與檢測：每孔加入 100μL HRP 標記的檢測抗體，輕輕振蕩混勻，再次用封板膜密封，37℃溫育 30 分鐘 。溫育結束后，重復上述洗滌步驟 。接著，每孔依次加入底物 A、B 各 50μL，輕輕振蕩混勻，避免產生氣泡，37℃避光顯色 15 - 20 分鐘 。顯色反應結束后，迅速向每孔加入 50μL 終止液，加入終止液后應立即使用酶標儀在 450nm 波長處測定各孔的 OD 值 。依據標準曲線，計算出樣本中 sTNF-1 的濃度，若樣本進行過稀釋，還需乘以相應的稀釋倍數得到實際濃度 。
三、注意事項
試劑盒中的所有試劑在使用前必須充分平衡至室溫，避免因溫度差異影響檢測結果的準確性 。同時，試劑使用后應及時放回冰箱冷藏保存，防止試劑變質 。
樣本采集、處理過程務必嚴格遵循規范操作，防止樣本受到污染或發生溶血、脂血等情況，以免干擾檢測結果 。如血清樣本應避免溶血，紅細胞溶解時釋放出的具有過氧化物酶活性的物質，可能會增加以 HRP 為標記的 ELISA 測定中的非特異性顯色 。
洗滌過程至關重要，既要確保充分去除雜質和未結合物質，又要避免過度洗滌導致已結合的物質脫落 。洗滌液的配制應準確無誤，洗滌次數和時間需嚴格按照說明書執行 。
加樣操作要精準、迅速，盡量縮短各孔之間的加樣時間間隔，保證實驗條件的一致性 。使用加樣器時，需定期校準，確保加樣量的準確性 。
顯色反應過程需嚴格控制時間和溫度，避免光線直射，以保證顯色效果的穩定性 。加入終止液后，應盡快進行 OD 值測定，一般建議在 15 分鐘以內完成，防止結果出現偏差 。
實驗過程中使用的所有耗材，如酶標板、吸頭、試管等，應確保無污染且質量可靠，避免對實驗結果造成影響 。
若對檢測結果存在疑問或出現異常情況，應及時檢查實驗操作過程、試劑狀態以及儀器性能等，必要時可重復實驗進行驗證 。
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