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平滑肌細胞原代培養方法
動物:大鼠150～180g,2～3只
操作步驟
大鼠頸椎脫臼致死
固定
消毒胸腹部
大組織鑷,組織剪切開胸腹部皮膚
另一組織鑷,組織剪切開胸腹部,并切除部分胸壁以利暴露
眼科鑷和眼科彎剪分離胸腹主動脈并放入盛有Hank's液的細胞培養皿中,轉入無菌室.或先用生理鹽水漂洗,再放Hank's液中,轉入無菌室
眼科直鑷和彎鑷去除血凝塊和血管外膜層.
放入另一盛有Hank's液的細胞培養皿中,剪去血管外的小分支
放入含20%胎牛血清的DMEM中,眼科直剪剪開血管腔,以眼科彎鑷輕輕擦拭內膜層,以去除內皮細胞
放入另一含20%胎牛血清的DMEM中,用眼科彎剪剪碎血管組織至1mm
用吸管把組織塊轉入玻璃培養皿中,均勻貼壁,組織塊的間距為0.5cm
蓋好瓶蓋,輕輕翻轉培養瓶,讓瓶底朝上,并向瓶內注入適量培養液,于37 C孵箱內放置4～5小時,使得組織塊干涸,并與瓶底貼附
將培養瓶慢慢翻轉平放,使組織塊*浸入培養液中,繼續靜置3～5天,切勿移動.待有細胞從組織塊周圍游離出后換液
平滑肌細胞傳代
傳代時間:大部分組織塊長出細胞暈,并與相鄰細胞暈相接觸時就可以傳代
傳代步驟:
倒掉培養瓶中的培養液
用D-Hank's液洗兩遍
加2-3滴0.25%胰蛋白酶消化液,平放培養瓶,在倒置纖微鏡下觀察細胞消化情況,可見到細胞質回縮,細胞間隙增大時迅速翻轉培養瓶,使細胞脫離消化液
注意:
初次傳代對胰酶敏感,加入消化液30s,即消化充分,以后2分鐘左右
細胞消化完成后,用吸管反復抽吸打散細胞
中止消化:加入DMEM培養液3滴管,用吸管反復吹打瓶壁細胞
離心:1500 X5分鐘
倒掉液體,加D-Hank's液洗一次,再加10mL DMEM培養液,用吸管抽吸吹打分散細胞,分裝于2個培養瓶.在倒置纖微鏡下可見圓形細胞.放入細胞培養箱中培養
血管平滑肌細胞的凍存和復蘇
凍存時間:較早期傳代,以防細胞因為傳代次數過多而造成細胞衰老或發生改變,以保持實驗條件的一致性.
凍存方法:凍存前24小時更換培養液,凍存時要將密閉好的凍存管依次放于:
4 C 2小時
-20 C 2.5小時
液氮表面 2小時
浸入液氮
培養細胞的鑒定
1,形態學鑒定:
用相差顯微鏡常規觀察細胞生長形態以及生長規律.并依據常規制作電鏡標本進行觀察
電鏡觀察結果:細胞形態不規則,胞漿內有肌絲,縱向排列,有密區,具備平滑肌細胞特征
2,免疫組織化學鑒定:
特異性鼠抗α-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體,采用SP法對細胞爬片進行免疫組織化學染色
免疫組織化學鑒定結果:
鏡下觀察到細胞爬片,可見細胞漿內大量平行陽性染色胞核不著色.所有細胞染色,結果均為陽性
培養試劑的配制
Hank's液 （單位g）
CaCl2 0.14
KCl 0.4
KH2PO4 0.06
MgSO4.7H2O 0.10
NaCl 8.0
NaHCO3 0.35
Na2HPO4.12H2O 0.12
D-glucose 1.0
Phenol red 0.01
將 CaCl2先溶解在100mL的ddH2O中,其它成分溶在750 mL的ddH2O中,混勻（用磁力攪拌器攪拌至溶解）,定容至1000mL.高壓蒸氣消毒10分鐘,4℃冰箱保存.
D-Hank's液 （單位:g）
KCl 0.40
KH2PO4 0.06
NaCl 8.0
NaHCO3 0.35
Na2HPO4.12H2O 0.08
Phenol red 0.02
將以上成分溶于900mL ddH2O中,充分混勻,加ddH2O至1000 mL.高壓蒸氣消毒10分鐘,4℃冰箱保存.
青霉素,鏈霉素液配制
青霉素80萬U加Hank's液至80 mL,終濃度1萬u/ mL
鏈霉素100萬U（相當于1g）加Hank's液至100 mL,終濃度10mg/mL
分裝后至-20℃冰箱保存.
DMEM培養液
900 mL ddH2O于1000 mL容器中,將DMEM粉1包倒入容器中,盛粉袋用50 mL ddH2O分次沖洗,也倒入容器,磁力攪拌溶解.
加NaHCO3
調PH至7.2
加青,鏈霉素至終濃度100u/mL 和100ug/mL
0.22umX50濾膜過濾（負壓泵抽吸）,4℃冰箱保存.
小牛,胎牛血清滅活
55℃水浴箱30分鐘,置4℃冰箱保存
滅活前放于-20℃冰箱保存待用
臨用前加入DMEM液中
血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCS ）位于動脈壁中膜，它對管壁的完整性和調節血管的緊張性起著重要作用.在經典的單層培養系統中，VSMCS 離開了在體內與細胞外基質共同構成的三維立體生長環境，因而所表現出的生物學特性與在體狀態存在較大的差異.我們在VSMCS 單層培養的基礎上，將兔主動脈VSMCS 置于膠原凝膠中，使其在體外與細胞外基質形成一個整體，觀察其在三維狀態下的生物學特征，為構造結構和功能與在體血管中膜相似的中膜組織，zui終形成組織工程化血管提供實驗依據.
動脈平滑肌細胞的培養
一、血管平滑肌細胞的培養
血管平滑肌細胞培養常用的方法有貼塊法（explant）和酶解離法（enzyme disperse）。貼塊法具有獲得平滑肌細胞純度高，量多，操作簡便的優點。但用貼塊法易使平滑肌細胞胞質內肌絲喪失，亞細胞器增加。相反，酶解離法，由于酶的作用使細胞間失去連接，細胞內肌絲含量豐富，保持收縮型狀態。培養平滑肌細胞常取材于兔、豬、鼠、猴的胸腹主動脈段。
1．貼塊法
方法：動物經頸動脈放血后，在無菌操作下迅速取出胸腹主動脈段，置于含Hank's液的平皿中漂洗3次，將凝塊洗干凈后剝除外膜的纖維脂肪層，然后縱行切開血管，刮除內膜即內皮細胞迅速撕下中膜內、中層，切成約1mm寬的小條，浸泡在含血清的Hank's液中，并將撕下小組織塊種植于培養瓶壁。置于37℃恒溫箱，2h左右，取出培養瓶加入20%胎牛血清的培養液，再放回培養箱內靜止培養4天。4天后可見細胞從組織中遷移游出。
不同動物血管結構有差異，豬和猴較易操作，但小動物如兔、鼠因其血管小，血管壁薄等特點，使之難以分離。另外組織塊太薄，不易粘附培養基，也使細胞較難生長。為了保證培養的成功，應注意：①種植組織塊的數目，如75cm2的長頸瓶組織塊不得少于30 ；②根據培養細胞的種屬加入適量的不同血清，一般可加入牛血清，若小牛血清增殖效果差，應加胎牛血清（FBS），通常濃度為10%～20%；③培養基的選擇：常用的有DMEM（Dulbecco's modified Eagles'medium），M199培養基。培養兔的平滑肌細胞用DMEM效果較好。
2．酶解離法
沿動脈縱軸切開后，刮除內皮細胞撕下中膜的內2/3，注意不要混入內皮細胞，將組織塊切成1-2mm2，放入加有3mg/ml膠原酶的無血清M199培養基中，37℃，0.5～1.5h。離心去上清，重復上述消化步驟，然后再離心（9000r,4min），收集細胞，在5%～10%同種血清或胎牛血清的M199培養基中調整細胞數，然后轉入30～90mm培養皿中培養，對于兔子應加入高濃度的谷氨酰胺（0.2g/L）較佳。不同研究者在培養基、酶濃度以及消化時間等的選擇都有很大的差異。
二、動脈平滑肌的特性
由于貼塊法和解離法處理方式不同，在細胞培養的zui初階段細胞形態和性質存在差異。隨著培養時間的延長，培養環境趨于一致，細胞特性上也趨于近似。
光學倒置顯微鏡下觀察：原代平滑肌細胞形狀多樣，一般常為梭形、帶形、三角形或星形。貼塊法培養，細胞可于2周后長成單層；而酶解離只需6～7天，鏡下可見明顯“峰-谷”樣生長。
透射電子顯微鏡下觀察：貼塊法，細胞多為合成型，肌絲減少，胞體縮小，細胞胞質內粗面內質網、游離核糖體、線粒體等亞細胞器逐漸增多。消化法，細胞初期表現為收縮型，細胞內核位于中心，胞質內含豐富的肌絲及致密度體。亞細胞器少，且位于細胞邊緣處，基底膜zui初未見，后來逐漸形成。傳代后，細胞逐漸轉為合成型，胞體增大且變扁平，核增大，核小體數目增加，亞細胞器也增加，肌絲開始減少，占胞內35.4%～11.5%,甚至更少。
另外，在體外實驗中，來自幼齡動物（兔，豬）的血管平滑肌增殖生長早且快，相反，老齡動物則生長緩慢。在生化性質方面，收縮型細胞比合成型細胞的β-極密度脂蛋白（β-VLDL）對其受體結合能力強，低密度脂蛋白（LDL）分解降低，即脂質容易在胞質沉著。此外，像基底膜中的肝素樣物質、膽固醇代謝等也有改變。合成型細胞內色素C氧化還原酶成倍增加，酸性磷酸酶亦呈3～4倍增加，說明兩類細胞不僅在形態學上，在生化、生理反應方面也發生了較大改變。
