二極管陣列檢測器——從現象到本質看木犀草素

沈國濱  施磊  金燕

01紫外檢測器的進階版本——二極管陣列檢測器(Diode Array Detector, DAD)

紫外檢測器(Ultraviolet Detector, UV)是目前HPLC應用廣泛的檢測器，其工作原理是朗伯-比爾定律。紫外檢測要求被檢測樣品組分具有紫外吸收，通常選擇在被分析物有最大吸收的波長處進行檢測，以獲得最大靈敏度和抗干擾能力。可惜這會導致其它組分在該通道下的吸收變弱甚至無紫外吸收。因此，單通道紫外檢測器在對目標化合物，特別是未知化合物進行純度及定量分析時，結果可能會產生嚴重的偏差。

圖1 朗伯-比爾定律（A=lg(1/T)=Klc）

二極管陣列檢測器(Diode Array Detector, DAD)是一種新型的光吸收檢測器，它采用光電二極管陣列作為檢測元件，形成多通道并行工作，可對光柵分離的所有波長的光信號進行檢測，從而迅速決定具有*性和靈敏度的波長。可得任意波長的色譜圖及任意時間的光譜圖，具有色譜峰純度鑒定、光譜圖檢索等功能，為定性、定量分析提供更豐富的信息。

圖2 二極管陣列檢測器

02 DAD在天然產物構型變化監測時的妙用

*味（學名：Lamiophlomis rotata）是唇形科*味屬植物，有活血祛瘀，消腫止痛的功效，是青藏高原*的一種重要藥用植物。木犀草素是*味葉中的主要成分 (Luteolin, CAS No. 491-70-3 )，是一種天然弱酸性的黃酮類化合物。木犀草素具有抗炎、抗過敏等作用，可用于治療COPD、支氣管哮喘以及慢性咽炎、變應性鼻炎等引起的慢性咳嗽。

圖3 木犀草素結構式

本文基于賽默飛液相色譜系統和二極管陣列檢測器，開發了一種可用于檢測中藥*味膠囊提取液中木犀草素含量的方法。通過DAD檢測器不僅可以實現定量分析，也可以用于色譜峰的定性分析。同時利用DAD全波長掃描的結果以證實木犀草素在流動相pH變化時會發生最大吸收波長紅移，從而影響其在C18色譜中的保留等現象進行解釋。

03 實驗部分

色譜條件

流動相pH值對色譜行為的影響

圖4 流動相不同pH對于保留時間和吸收波長的影響

實驗結合文獻表明木犀草素對于流動相的pH敏感，依據計算模擬表明木犀草素的pKa 為 6.5±0.4。即在中性時，部分木犀草素可能以極性較強的離子形式存在，保留較弱；當調節pH為酸性時，抑制了電離，使得該分子以分子形式存在。借助二極管陣列檢測器（DAD），可以實現全波長掃描，可以獲得更全面的紫外光譜信息。木犀草素的紫外吸收波譜也對流動相的pH敏感，不僅保留時間產生了較大的差異，且隨著堿性增強，最大吸收波長產生紅移。表明該物質會在不同pH條件下產生不同的構象，且構象的變化會引起共軛結構的變化。

樣品分析結果

圖5 標準品與樣品對照色譜圖（藍色：標準品，黑色：樣品）

圖6 樣品DAD三維色譜圖（插圖：8.640分鐘的紫外吸收光譜圖）

木犀草素保留良好，色譜峰形對稱，無雜質干擾，可用于定性和定量分析。在0.3~100 μM 的范圍內線性良好，相關系數R2達0.9999。進樣精密度良好，標準品和樣品的保留時間RSD均小于為0.2 %，峰面積RSD均小于為0.9 %。根據分析標準品保留時間的紫外吸收光譜，可見樣品中對應色譜峰的最大吸收波長與木犀草素一致，推斷該物質為木犀草素。根據校正曲線計算可得*味膠囊提取液中木犀草素的摩爾濃度為27.4 μM。通過在樣品中加入已知濃度的標準品來判斷方法的準確性，該方法的回收率在95.9~103.0%之間。

04 結論

本文基于賽默飛液相系統和二極管陣列檢測器，開發了一種可用于檢測中藥*味膠囊提取液中木犀草素含量的方法。通過DAD檢測器不僅可以實現定量分析，也可以用于色譜峰的定性分析。利用DAD全波長掃描結合其它有關計算，驗證了木犀草素在不同pH條件下最大吸收波長產生了紅移，從而影響其在C18色譜中的保留。本文報道的方法能為極性小分子檢測方法的開發提供定性和定量分析實驗基礎，為闡明色譜柱中的保留機理提供了理論依據，凸出了全波長掃描DAD檢測器在分析物質變化過程和監測反應過程時的優勢。