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關鍵詞 全自動 SRM 離子對優化軟件（AutoSRM）；生物標記物；食 品；代謝組學；MRM；營養學；大米

前言 代謝組學是一門應用高通量測試平臺研究生物代謝過程中的小 分子代謝物的科學。作為生物體內眾多代謝反應的產物，其代 謝物的含量始終處于動態變化中。因此，所謂“代謝組特征” 反映的是來自于活體組織的生物樣本的生理狀況。1 對于植物來說，其代謝組主要受遺傳基因以及環境影響等外部 刺激作用而在生長過程中不斷變化。因而，通過測試所獲得的 代謝組特征僅為該植物某組織器官在特定生長階段生理狀況的 剪影。對樣本中代謝物的定性和定量結果可作為此代謝組狀態 的“指紋圖譜”或指示譜圖。據估計，所有植物生長過程中存 在超過 20 萬種代謝物，這些代謝物數量眾多，結構復雜多樣。2 代謝組學分析的大挑戰在于代謝物結構性質的多樣性以及含 量的巨大差異。要對整個代謝組體系中的代謝物進行測試，必 須應用多種測試平臺。 對于研究可通過化學衍生法處理進行氣相色譜分析的低分子量 代謝物來說，氣相色譜與質譜聯用（GC-MS）是測試 工具。在使用氣質聯用儀一級全掃描模式表征代謝物，可識別 相關代謝物并提供其歸一化相對含量信息，然而，對代謝物整 體定量研究的要求是獲得準確的定量信息。在研究大米等 某一植物時，需要對作為功能基因組學工具或區別不同種屬、 品質大米的生物標記物的目標代謝物進行準確定量

三重四極桿質譜儀由于其在復雜有機樣本中對待測物進行定性 和定量的能力而成為代謝組學研究中價值的工具之一。3, 4 三重四極桿質譜的主要優勢是利用其多重反應監測（MRM）功能，一次進樣同時定性和定量上百種代謝物。MRM 數據采 集模式通過監測目標代謝物*的、保留時間相關的母離子子離子轉化反應，有效消除基質和噪音的干擾。并且，共流出 化合物也可以分別定量，無需通過數學計算進行解卷積處理。 作為一種食物來源，大米對于我們至關重要，它為約 21% 的 人口提供了能量供給（http://www.knowledgebank.irri.org/）。 大米的代謝組研究可用于對不同大米樣本進行“指紋圖譜” 識別，以鑒定出具有發展潛力的種屬，從而揀選更好品質、 具備更多營養成分的大米。位于菲律賓馬尼拉的稻米研究 機構（International Rice Research Institute, IRRI）是目前亞洲 大的非營利性農業研究中心。IRRI 以提高稻米產量和營養成 分為目標，專注于稻米的新品種開發。本次分析目的是考察 GC-MS/MS 測試平臺對于檢測不同基因型成熟稻粒目標代 謝物的適宜性。本實驗與 IRRI 合作完成，旨在建立表征不 同種類稻米的代謝特征的測試流程。

 樣品前處理 大米提取物的衍生化處理依據 Zhou 等人5發表的用于表征糙 米代謝組學特征而優化的方法完成。將新鮮脫殼的稻粒浸泡于 液氮中，之后研磨過 60 目網篩。稱量 300 毫克糙米粉末，加 入 3 mL 甲醇/水溶液（4:1 v/v），另加入 100 µL 癸酸溶液 （0.30 mg/mL）作為內標物質。上述樣本渦旋 1 分鐘并靜置 30 分鐘，經超聲處理 60 分鐘后 12000g 離心 10 分鐘。取 2 mL 上清液凍干，加入 90 µL 含 1%*基氯硅烷（TMCS） 的雙*基硅烷基三氟yi酰胺（BSTFA）和 80 µL 吡啶進行衍 生化。混合物經 75℃ 水浴 45 分鐘后移入裝有 200 µL 內插管 的 2 mL 氣相色譜樣品瓶中，用于 GC-MS/MS 分析。所有樣 本均在衍生化處理后 24 小時內完成測試。5 實驗條件 12 份大米提取物衍生化樣本均應用 Thermo ScientificTM TSQTM 8000 三重四極桿 GC-MS/MS 系統聯用 Thermo ScientificTM TRACETM 1310 氣相色譜分析，氣相色譜儀同時配備有分流不 分流進樣口 SSL 即時連接的 SSL 模塊和 Thermo ScientificTM TriPlus RSHTM 自動進樣器。具體儀器方法見表 1。

圖 1 展示了代謝組學研究的通用測試流程，首先是第一部分， 無目標性地檢測樣本中化合物成分；之后進行第二部分，對第 一部分中鑒定的代謝物進行目標性的定量分析。 第一部分分析需要通過對一級質譜全掃描數據進行譜圖數據庫 檢索來完成相關化合物鑒定。 第二部分分析則通過選擇性反應監測（SRM）模式來對復雜 基質中痕量化合物進行準確定量。 終用于選擇性定量的多重反應監測（MRM）是由眾多單獨 的選擇性反應監測組成的。

TSQ 8000 系統同時進行一級質譜全掃描和 SRM 掃描的能力出 色，能夠直接采集到第一部分和第二部分所需要所有數據。儀器 同時進行一級質譜全掃描和 SRM 掃描的能力使得實驗人員可以 在一次測試中不僅對已知代謝物定量（目標性）的同時，鑒定未 知代謝物（無目標性）。在所有測試流程中，化合物的色譜保留 時間是不變的，這一點不僅可作為化合物鑒定的依據之一，更可 以加快建立目標性 MRM 測試方法進程。因此，Thermo Scientific TSQ 8000 三重四極桿質譜系統是同時進行未知化合物表征以及 目標化合物廣泛定量的理想測試平臺。 本次應用 TSQ 8000 GC-MS/MS 系統進行代謝組學研究的兩部分 數據對于深入了解稻米品質具有重要參考價值。

結果 第一部分—無目標性分析 測試流程中的第一部分，共測試了 5 種不同的大米樣本。之所以 選擇這幾種大米，是由于它們不同的特性，這樣更有可能測試出 含量具有顯著差異的代謝物。測試樣本的一級全掃描離子流圖見 圖 2。 選擇其中一個樣本（3 號樣本）來建立和優化 SRM 方法。這個 樣本中含有大量有意義的代謝物。 TSQ 8000 三重四極桿質譜儀配置了全自動 SRM 離子對優化 （AutoSRM）功能，這個軟件包可以快速、自動化地建立和優化 SRM 分析方法。利用該功能建立一個優化 SRM 方法步驟如下：1.分析母離子—根據一級全掃描數據，選擇出 66 種感興趣的 代謝物，每個代謝物選擇 2–3 個母離子。本步驟需要單獨進 行一次 GC-MS/MS 測試，選擇出的相關母離子將進行進一 步的子離子分析。 2.子離子分析—選出在第一步中各代謝物選出的母離子的相應 子離子。每個代謝物均被選出多個產物離子，這導致每個代 謝物有 3–7 對母離子子離子離子對用于 SRM 優化分析。 3.SRM 優化分析—優化每對母離子-子離子離子對的碰撞能 量，以獲得大的離子強度，即靈敏度。在目標代謝物進入 質譜儀后，對其進行快速梯度能量轟擊以提高離子強度。通 過實時直接控制儀器，在單次測試中試驗了多個碰撞能量， 從而極大地縮短了建立和優化 SRM 方法所需要的周期。僅 測試了 5 針樣品就所有 66 種代謝物的 SRM 方法優化。 通過質譜圖自動解卷積和鑒定軟件（AMDIS）對 TSQ 8000 測 試所得的復雜離子流圖進行解卷積處理，并應用美國國家標準 與技術研究院（NIST）的質譜圖數據庫進行譜圖檢索。上述的 66 種進行 AutoSRM 優化的代謝物均通過 2011 NIST 質譜圖數 據庫檢索匹配其一級全掃描質譜圖以完成鑒定。

……更多信息聯系賽默飛

結論 應用 Thermo Scientific TSQ 8000 對 IRRI 提供的不同基因型的 大米進行代謝組學表征研究，旨在鑒定出能夠區別不同種類、 品質大米的潛在生物標記物。無論代謝組學測試流程中的無目 標性分析還是目標性定量分析，TSQ 8000 均運行良好，展現了 它的一級質譜全掃描、SRM 和同時進行一級質譜全掃描 / SRM 掃描模式對于表征、定量寬動態范圍內的主要代謝物的*優 勢。 盡管 TSQ 8000 質譜儀是一臺三重四極桿質量分析器，在一級 質譜全掃描模式下所獲得的譜圖仍與 NIST 標準譜庫具有良好 的匹配度。通過標準譜庫檢索可對未知化合物進行匹配鑒定， 結果置信度高。同分異構體化合物則可根據其色譜保留時間不 同而進行區別，并可根據其特定的質譜碎裂特征進行選擇性定 量。 利用 TSQ 8000 配置的 AutoSRM 軟件包建立并優化大米樣品中 包括氨基酸、有機酸、脂肪酸、醇類、糖類（單糖、雙糖）在 內的 66 種代謝物的 SRM 方法。整個 SRM 方法可在 24 小時以 內建立并完成優化，并對 12 種不同的大米樣品中的代謝物進行 測試。定量結果具有高重復率，即使是在基質復雜的衍生化大 米提取物樣品中，超過 90% 的代謝物 RSD 小于 15%。 經測試，所有目標代謝物在各大米樣品中含量差異明顯，均有 作為鑒定不同種類大米的生物標記物的潛力。本次實驗對于未 來的水稻多樣性研究打下良好基礎，有助于提高稻谷品質和大 米營養價值。