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關鍵詞： 單克隆抗體，游離糖型，糖肽，完整蛋白，Q Exactive Plus超高分辨質(zhì)譜儀，Vanquish Flex Binary超高壓二元液相色譜儀，熒光檢測器

前言 重組單克隆抗體（mAbs）已是日益廣泛使用的治療性蛋白質(zhì)藥 物，其中以IgG1和IgG2類型為常見。其恒定區(qū)的N糖基化在 不同的細胞系、克隆和生產(chǎn)條件之間的差異很大，且具有高度 的異質(zhì)性，聚糖結構或不同聚糖類型含量的改變通常影響抗體 生物學活性、穩(wěn)定性、免疫原性和半衰期，是許多治療性抗體 的關鍵質(zhì)量屬性，對控制產(chǎn)品一致性至關重要[1]。 分析不同寡糖結構和含量的傳統(tǒng)策略為通過PNGase F糖苷內(nèi)切 酶將寡糖從抗體中釋放，對糖鏈進行標記、熒光對其進行定性 和定量，然而其局限于需要寡糖標準品，且當抗體中含有多個 N糖基化位點時，不能區(qū)分位點的異質(zhì)性，而基于高分辨質(zhì)譜 對寡糖及糖肽的定性和定量則能夠解決上述問題，但定量時需 考慮不同離子的離子化效率不同。本文采用LC-MS/MS法對原 研IgG1抗體藥物的N糖肽及游離寡糖進行鑒定和相對定量，同 時與經(jīng)典方法LC-FLD進行定量結果的比較。

 實驗方法 1.試劑 10 kD超濾管（P/N MRCPRT010，Merck），8 M鹽酸胍 （P/N 24415，Thermo Fisher），1 M Tris-HCl pH=8.0（P/N 15568025，Thermo Fisher），二硫蘇糖醇（P/N D9163- 5G，Sigma-Aldrich）,碘乙酰胺（P/N I6125-10G，SigmaAldrich），胰蛋白酶（P/N V5117，Promega），Glycoworks RapiFluor-MS（P/N 176003635，Waters），質(zhì)譜級甲酸（P/N 85178，Thermo Fisher），質(zhì)譜級乙腈（P/N 51101，Thermo Fisher），質(zhì)譜級水（P/N 51140，Thermo Fisher）

2.樣品制備 單抗樣品酶解：加入200 μL ddH2O 到10 kD 超濾管中，11,000 g離心1min，去除超濾管中少量的甘油。加入100 μg單 抗，11,000 g離心3 min。加入200 μL ddH2O 置換一次去除樣 品中的鹽。加入98 μL 8 M鹽酸胍，加入2 μL 500 mM DTT， 終濃度10 mM，56℃，反應30 min。加入2 μL 1 M 碘乙酰胺， 終濃度20 mM，室溫，避光，反應30 min。反應液11,000 g離 心10 min。加入200 μL 終濃度為100 mM Tris-HCl（pH=8.0） ，11,000 g離心10 min，重復一次。用100 μL 100 mM Tris-HCl 復溶，加入2.5 μg Trypsin 37℃孵育4 h。加入10 μL 10%甲酸酸 化（終濃度約為1%甲酸），單抗肽段終濃度約1 μg/μL。 糖鏈的釋放及熒光標記：參照Glycoworks RapiFluor-MS試劑盒 說明書，即使用RapiGest SF和Rapid PNGaseF酶將糖鏈快速 釋放；將糖鏈釋放混合物與RapiFluor-MS混合，室溫標記5min 后，用乙腈稀釋該反應混合物；利用GycoWorks HILIC μElution 提取板對已標記的糖胺進行純化，實驗詳細步驟參照相應說明 書。

 3.液相、質(zhì)譜設備及分析方法 質(zhì)譜儀器: Thermo Fisher Q Exactive Plus高分辨質(zhì)譜儀 液相色譜: Thermo Fisher Vanquish Flex Binary超高壓二元液相 色譜儀，包括二元梯度泵（P/N VF-P10-A），柱溫箱（P/N VH-C10-A），進樣器（P/N VF-A10-A-02），基座（VF-S01- A），熒光檢測器（P/N VF-D51-A），熒光流通池（P/N 6079.4330） 色譜柱: AccucoreTM C18 2.1×150 mm色譜柱（P/N 27101- 152130，Thermo Fisher），ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide 1.7μm，2.1mm×150mm色譜柱（P/N 186004742，Waters ） 數(shù)據(jù)分析軟件: Thermo Fisher BioPharmaFinder3.1，免費軟件 GlycoWorkbench 色譜方法: 見表1A，表1B 質(zhì)譜方法: 見表2A，表2B 

 4.數(shù)據(jù)分析 使用BioPharma Finder 3.1軟件分別對LC-MS/MS采集的抗體完整分子量和糖肽進行鑒定和相對定量，主要分為：第yi步序列編 輯，使用BPF 3.1自帶的CHO糖型庫，第二步設置具體解析參數(shù)，第三步查看結果，肽圖分析具體參數(shù)設置如圖1A所示；完整蛋 白分子量測定具體參數(shù)設置如圖1B所示。根據(jù)BPF 3.1軟件中182種糖型，對LC-MS/MS采集的游離糖型進行一級分子量的提 取，并使用GlycoWorkbench軟件對提取到的糖型進行二級碎片離子的確證。

實驗結果 1.基于LC-MS/MS方法對游離糖型、糖肽和完整蛋白水平糖型 鑒定結果的分析 在沒有游離糖標準品時，利用Orbitrap高分辨質(zhì)譜一級分子量和豐富的糖碎片離子能夠?qū)崿F(xiàn)對未知糖型的鑒定，同時與 糖肽鑒定結果進行相互的驗證。本次實驗利用軟件GlycoWorkbench對糖型結構進行鑒定，如圖2所示以A2G0F糖型為例的碎 片離子匹配圖，本次實驗中共鑒定到16種游離糖型。

 此外，基于Orbitrap高靈敏度、HCD產(chǎn)生的豐富碎片離子及BioPharmaFinder軟件含有的182種CHO N糖型庫，在本次實驗中 共鑒定并相對定量到20種不同的N糖肽，其一級質(zhì)量偏差均小 于5ppm，且含有較為豐富的碎片離子，如Y1，Y1-F及糖的碎 片離子，以豐度低的N糖肽M8（相對含量為0.07%）為例， 其一級質(zhì)量偏差為1.8ppm，二級仍具有豐富的碎片離子，如圖 3所示，得以充分確證并準確定量各種低含量的翻譯后修飾。

 完整蛋白水平糖型的鑒定無需樣品前處理，是為直接的方 法，但由于完整蛋白分子量大、異質(zhì)性高且在色譜上難分離， 對質(zhì)譜的檢測要求更高，如圖4所示本次實驗中共鑒定并相對定 量到6種高豐度的不同糖型。

2.比較LC-MS/MS和熒光法對游離糖型、糖肽和完整蛋白水平 的定量結果 表3中熒光和質(zhì)譜法對游離糖型的定量及糖肽水平定量結果顯 示，兩者對含量高于1%的糖型定量結果趨勢一致，可以說明高 含量的這幾種糖型在質(zhì)譜源區(qū)的離子化效率對定量結果影響不 大，對于低豐度糖型定量趨勢出現(xiàn)差異，可能由樣品前處理或 質(zhì)譜離子化效率導致，需進一步驗證。完整蛋白水平對高含量 糖型的定量與糖肽和游離糖型的結果趨于一致，可用于日常快 速監(jiān)測高豐度糖型的變化。 

總結和討論 在完整蛋白分子量測定和糖肽水平均可使用高分辨質(zhì)譜進行糖 型分析，高分辨質(zhì)譜和經(jīng)典的液相色譜法同樣能夠?qū)τ坞x糖鏈 進行糖型的鑒定和定量，即目前有4種分析方法能夠?qū)崿F(xiàn)對糖 型的分析。基于完整蛋白水平的糖型分析，前處理簡單、質(zhì)譜 分析時間短，是為簡單的方法，但對糖型種類多、異質(zhì)性高 的抗體而言，不同成分在質(zhì)譜離子源區(qū)域的離子化程度可能會 不同，導致低豐度糖型會鑒定不到，但可用于監(jiān)測高豐度糖型 的變化；基于高分辨質(zhì)譜的糖肽水平糖型分析，需經(jīng)過抗體酶 解，LC-MS分析時間較長，糖肽上糖型的準確鑒定依賴于高分 辨質(zhì)譜的靈敏度、碎片離子的豐富度及糖型數(shù)據(jù)庫的大小，相 對定量時需考察不同糖型的離子化效率，如滿足以上條件，此 方法作為糖型監(jiān)測為高效和靈敏的方法，同時能夠準確鑒定 糖基化位點，當對含有2種或2種以上不同糖基化位點的蛋白類 藥物糖型監(jiān)測時優(yōu)勢更為明顯；基于高分辨質(zhì)譜對游離糖型的 定性和定量方法，為提高質(zhì)譜響應需進行糖型的標記，此標記 過程復雜或試劑昂貴，以及是否會影響某類糖型的鑒定和定量以及不同糖型在質(zhì)譜離子源區(qū)的離子化效率仍需考察，但靈敏 度明顯高于液相色譜法；基于液相色譜法對游離糖型的定性和 定量，前處理同樣稍復雜，但無需考察離子化效率問題，依賴 于標準品和保留時間，靈敏度稍差，適用于大規(guī)模監(jiān)測生產(chǎn)中 的主要糖型。本文中建立的4種方法都可以地對單抗的糖型 進行表征，基于質(zhì)譜的表征方法較色譜法有很大的優(yōu)勢，具有 靈敏度高、樣品處理簡單以及獲得糖型信息更加完整的優(yōu)勢， 有望用于單抗大規(guī)模生產(chǎn)中糖型的監(jiān)測。

參考文獻 [1] Wang T, Chu L, Li W, et al. Application of a quantitative LC–MS multiattribute method for monitoring site-specific glycan heterogeneity on a monoclonal antibody containing two N-linked glycosylation sites[J]. Analytical chemistry, 2017, 89(6): 3562- 3567.