HPLC技術主要應用是在臨床藥學和臨床生理學中。臨床藥學主要是治療藥物監測(TDM)和藥代動力學。HPLC之所以在TDM中占有重要地位。其主要原因是：
    (1)可以同時監測不同種類的藥物。
    (2)一次進樣可同時分析原藥及代謝產物。
    (3)分離和定量同時進行．具有較高的準確性和度。此外HPLC還具有*的經濟效益比，花費遠遠低于其它傳統方法。目前用HPLC分析臨床常用藥物 超過數百種。已廣泛用于TDM中的如抗癲癇藥，抗心律失常藥。茶堿．撲熱息痛，環孢霉索等。在臨床生理研究方面，許多復雜化合物或內源代謝物也可用 HPLC法分析。如血中兒茶酚胺、氨基酸、激素、前列腺素、多肽、核酸等。
此外HPLC還可應用到臨床診斷中，如在新生兒疾病篩查中，開發了血紅蛋白病的Hb，苯丙酮尿酸癥的PKU，成神經細胞瘤等方法。
    需要注意的是臨床樣品都是生物樣品，如血、尿、痰、體液等，成分復雜，性質各異，生物大分子多，必須進行適當的處理，去除某些干擾物。處理時嚴格按要求去做，否則會導致實驗失敗或造成柱的阻塞，甚至報廢。