線粒體復(fù)合體Ⅳ試劑盒說(shuō)明書

分光光度法 25 管/24 樣

線粒體復(fù)合體Ⅳ試劑盒 氧化磷酸化

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

線粒體復(fù)合體Ⅳ又稱細(xì)胞se素C 氧化酶，也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分，負(fù)責(zé)催化還原型細(xì)胞se素C 的氧化，并最終把電子傳遞給氧，生成水。

測(cè)定原理：

還原型細(xì)胞se素 C 在 550nm 有特征光吸收，線粒體復(fù)合體Ⅳ催化還原型細(xì)胞se素 C 生成氧化型細(xì)胞se素C，因此 550nm 光吸收下降速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅳ酶活性。

試劑的組成和配制：

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、準(zhǔn)確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞，加入 1ml 試劑一和 10ul 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、將勻漿 600g，4℃離心 5min。

3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

4、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅳ（此步可選做）。

5、步驟 4 中的沉淀即為線粒體，加入 200ul 試劑二和 2uLl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超聲 3s，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于復(fù)合體Ⅳ酶活性測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 550nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

工作液的配制：臨用前取試劑四、試劑五、試劑六各一支，將試劑五和試劑六依次轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

將工作液置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）孵育 5min；

在 1ml 玻璃比色皿中加入 80μl 樣本和 800μl 工作液，混勻，記錄 550nm 處初始吸光值 A1 和 37℃

反應(yīng) 30min 后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

注意事項(xiàng):

1、若ΔA 大于 0.2，需將樣本用試劑二稀釋適當(dāng)倍數(shù)（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），使A1-A2 小于 0.2，可提高檢測(cè)靈敏度。

2、動(dòng)物肝臟樣本由于酶活性過(guò)高， 1 分鐘內(nèi)吸光值就會(huì)到達(dá)平臺(tái)期，務(wù)必先進(jìn)行 2 個(gè)樣本的預(yù)測(cè)定。可將樣本用試劑二稀釋 10~50 倍，反應(yīng)時(shí)間縮到到 30 秒或 1 分鐘（計(jì)算公式中代入實(shí)際反應(yīng)時(shí)間，并乘 以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）。其他樣本可按照正常測(cè)定步驟進(jìn)行。

復(fù)合體Ⅳ活力單位的計(jì)算：

按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化降解 1 nmol 還原型細(xì)胞se素C 定義為一個(gè)酶活力單位。復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=19.20×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化降解 1nmol 還原型細(xì)胞se素 C 定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=3.88×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化降解 1nmol 還原型細(xì)胞se素C 定義為一個(gè)酶活力單位。復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.008×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，8.8×10-4 L；ε：細(xì)胞se素C 摩爾消光系數(shù)，1.91×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.08 ml；V 樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。

線粒體復(fù)合體Ⅳ試劑盒 氧化磷酸化