實時熒光定量PCR儀
實時熒光定量PCR儀（Real-Time Quantitative PCR，qPCR）是一種用于定量分析核酸（DNA或RNA）擴增的儀器。該技術結合了聚合酶鏈反應（PCR）和熒光探針技術，可以在PCR反應過程中實時監測核酸擴增，廣泛應用于分子生物學、醫學診斷、基因表達研究等領域。
工作原理
實時熒光定量PCR儀的核心原理是利用熒光信號來監測PCR擴增過程中的DNA或RNA數量變化。其基本過程包括以下幾個步驟：
樣本準備：提取待測樣本中的DNA或RNA，進行逆轉錄（若檢測RNA）以生成cDNA。
PCR反應體系準備：將模板核酸、特異性引物、DNA聚合酶、dNTPs、緩沖液和熒光探針或染料混合，加入到PCR反應管中。
PCR循環：PCR儀通過循環變溫步驟（變性、退火和延伸）進行DNA擴增。每個循環的擴增產物量呈指數增長。
熒光信號檢測：每次PCR循環結束后，儀器通過熒光檢測系統測量熒光強度。熒光強度與擴增產物的數量成正比。
數據分析：根據熒光信號的變化曲線，軟件自動計算出起始模板的數量，實現定量分析。
主要組件
熱循環系統：包括加熱和冷卻裝置，用于精確控制反應管的溫度，執行PCR循環的變性、退火和延伸步驟。
光學檢測系統：包括光源、濾光片和檢測器，用于激發熒光染料或探針并檢測其發出的熒光信號。
軟件系統：用于控制儀器運行、數據采集和分析。軟件可以實時顯示PCR擴增曲線，計算起始模板量，并進行多種數據處理和輸出。
熒光檢測技術
SYBR Green染料：一種非特異性染料，能與雙鏈DNA結合并發出熒光。優點是簡單易用，成本較低，但可能會產生非特異性信號。
TaqMan探針：一種特異性探針，含有熒光報告基團和猝滅基團。當探針結合到目標序列上時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將報告基團與猝滅基團分離，釋放熒光。優點是特異性高，靈敏度強。
Molecular Beacons探針：一種發夾狀探針，含有熒光基團和猝滅基團。當探針與目標序列結合時，發夾結構打開，釋放熒光。優點是特異性強，但設計和使用相對復雜。
應用領域
基因表達分析：實時定量PCR可以準確測量不同條件下基因的表達水平，廣泛應用于基因功能研究和疾病機制研究。
病原體檢測：用于檢測和定量分析病毒、細菌等病原體的存在和數量，常用于臨床診斷和公共衛生監測。
遺傳變異分析：可以檢測單核苷酸多態性（SNP）、插入/缺失變異等遺傳變異，應用于個體化醫學和遺傳病研究。
藥物代謝研究：評估藥物在體內的代謝情況，研究藥物對基因表達的影響，應用于藥物研發和毒理學研究。
食品安全檢測：檢測轉基因成分、食源性病原體等，確保食品安全。
優勢
高靈敏度和特異性：能夠檢測和定量分析極低豐度的核酸，特異性強，適用于復雜樣本。
實時監測：無需后續處理，實時監測擴增過程，減少操作步驟和實驗時間。
定量分析：通過標準曲線或絕對定量方法，準確測量樣本中目標核酸的初始量。
使用注意事項
樣本質量：確保樣本中DNA或RNA的完整性和純度，避免抑制劑影響PCR反應。
反應體系優化：優化引物和探針設計，調整反應條件，提高擴增效率和特異性。
數據分析：正確設置熒光閾值和基線，確保數據分析準確可靠。
實時熒光定量PCR儀因其高靈敏度、高特異性和定量分析能力，成為現代分子生物學研究和臨床診斷的重要工具。了解其工作原理和使用方法，有助于更好地應用該技術，推動科研和應用的發展。
中級會員·2年
提 供 商
資料大小
資料類型
資料圖片
下載次數
瀏覽次數