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如何用二氧化碳培養箱做細胞凋亡誘導試驗?

閱讀:2231        發布時間:2017/9/25
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【實驗方法與步驟】

(1)細胞凋亡的誘導:HeLa細胞常規傳代培養至對數生長期(見細胞傳代培養)。實驗組細胞加入順鉑溶液(生理鹽水配置)至終濃度為20μmo1/L,二氧化碳培養箱設定37℃,5% CO2條件下繼續培養。空白實驗對照加入等體積的生理鹽水,同樣條件繼續培養。24h后進行染色及形態學觀察。      

(2)胰酶消化細胞,將培養基上清及消化下來的細胞一同轉入離心管中600~800r/min離心10min。     

(3)吸去上清,用1mL PBS重懸細胞沉淀,并轉入1.5mL微量離心管中,600~800r/min離心10min。    

(4)吸去上清,用500μL PBS重量細胞沉淀,取178μL轉入0.5mL的微量離心管中,加入PI 20μL(終濃度100μg/mL),Hoechest 33342 2μL(終濃度10μg/mL),混勻,37℃溫箱中避光標記15min。     

(5)600~800r/min離心10min,棄上清,加50μL PBS重懸細胞。    

(6)分別從實驗組及對照組中取10μL細胞懸液滴于載玻片上,蓋上蓋玻片。     

(7)熒光顯微鏡20倍物鏡在紫外光激發下觀察,可觀察到凋亡細胞核形態發生明顯的改變,出現染色質凝集及邊緣化。

【注意事項】       

(1)誘導細胞凋亡后收集細胞時,注意要同時收集細胞培養基上清液。   

(2)懸浮細胞時動作要輕柔,避免損傷細胞。     

(3)在實驗中可同時設計壞死細胞的對照,例如,取正常細胞經低滲后進行染色觀察。

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