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細胞名稱：Walker/LLC-WRC256大鼠腹水癌細胞ATCC
細胞代次：P4
細胞規格：T25瓶（包郵）/2冷凍管（需加干冰運輸費）
細胞凍存：無血清凍存液
細胞傳代：第一次建議1:2
培養步驟
a、細胞傳代:如果未超過80%匯合度時,將瓶裝的培養液收集至離心管中,留5ml培養基,放入37℃、5%CO2孵
箱培養;如果細胞密度超80%,即可進行傳代培養,
1)對于貼壁細胞,傳代可參考以下方法:
1. 棄去培養上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2. 添加0.25%ydbm消化液約1-2ml至培養瓶中,置于37℃培養箱中消化1-2min,然后在顯微鏡下觀察細胞
消化情況,若細胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養瓶后加5ml以上培養基終止消化。
3.輕輕吹打細胞,使之脫落后吸出,然后將懸液轉移至15ml離心管中,在1000RPM條件下離心5分鐘,棄去上清液
,補加1-2mL培養基重懸。
4. 將細胞懸液按1:2的比例進行分瓶傳代(兩個T25瓶),補充新的培養基至5-8ml/瓶, 放入到37℃、5%CO2的細
胞培養箱中培養。
2、對于懸浮細胞,傳代可參考以下方法:
方法一:收集細胞,1000RPM條件下離心8-10分鐘,棄上清液,補加1-2ml培養液后吹勻,將細胞懸液按1:2的比例
分到新的含8ml培養基的新瓶中。
方法二:可選擇半換液方式,棄半數培養基后,將剩余細胞懸起,將細胞懸液按1:2比例分到新的含8ml培養基新瓶
中。
b、細胞凍存:
1、細胞生長至覆蓋培養瓶的80%面積時,棄T25培養瓶中的培養液,用PBS清洗細胞一次;
2、添加0.25%消化液約1ml至培養瓶中,倒置顯微鏡下觀察,待細胞回縮變圓后加入5ml培養液終止消化,再輕
輕吹打細胞使之脫落,然后將懸液轉移至15ml離心管中,1000rpm離心 5min;
3、 棄上清,沉淀細胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液(貨號:C7001),混勻后加入凍存管中。
4、 將凍存細胞直接放入-80℃冰箱即可,如后期要將細胞轉入液氮罐中,則需在-80℃冰箱 中存放24小時以上
再轉入液氮罐中。C、細胞復蘇:
1、從液氮中取出細胞凍存管(注意佩戴防護面具),快速將其置入 37℃水浴中解凍, 直至凍存管中無結晶,然后
用75%的酒精擦拭凍存管外壁;
2、將凍存管中的細胞移至含 5ml 培養基的15ml離心管中,1000rpm離心5min;
3、棄上清,沉淀用5ml培養基重懸,接種至T25培養瓶,放于37℃,5%CO2細胞培養箱中培養; 天,換用新鮮培養
基繼續培養。
C、細胞復蘇:
1、從液氮中取出細胞凍存管(注意佩戴防護面具),快速將其置入 37℃水浴中解凍, 直至凍存管中無結晶,然后
用75%的酒精擦拭凍存管外壁;
2、將凍存管中的細胞移至含 5ml 培養基的15ml離心管中,1000rpm離心5min;
3、棄上清,沉淀用5ml培養基重懸,接種至T25培養瓶,放于37℃,5%CO2細胞培養箱中培養; 天,換用新鮮培養
基繼續培養。
注意事項：有些細胞比較特殊，如貼壁不牢，在運輸過程中發生容易細胞脫落，這是正常現象。請將培養瓶所有培養液收集至離心管，1000rpm離心5min，收集上清作過渡培養（后期對比培養），沉淀加入消化液1-2ml，輕輕吹打，重懸，消化1-2分鐘后，加5ml培養基終止反應。再離心，棄上清，加1-2ml培養基重懸。然后按1:2比例進行分瓶傳代（兩個T25），補充新的培養基至5-8ml/瓶，最后放入37℃,5%CO2細胞培養箱中培養。
收到貨后處理：
培養至良好狀態后灌滿培養液并封好瓶口是運輸細胞的 辦法。收到細胞用75%酒精噴灑整個細胞瓶,消毒后
放到超凈臺內嚴格無菌操作,將細胞瓶放入37℃、5%CO2的培養箱中靜置3-4小時以穩定細胞狀態后再做處
理。顯微鏡觀察細胞生長情況,并對細胞進行不同倍數拍照保存( 40x,100x,200x各一張),前三天照片是重要售
后依據,不提供照片默認收到狀態良好。(傳代后建議一瓶用原瓶的培養基,另外一瓶用自己配的培養基,以便進
行對比培養,換液擰松瓶蓋),該細胞的STR鑒定可向客服咨詢索取。
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