pcr實驗原理：
qPCR基于傳統的聚合酶鏈反應（PCR）技術，通過逐漸擴增目標DNA或cDNA的數量使其可檢測。與傳統PCR不同的是，qPCR在擴增過程中同時進行熒光信號的實時監測。
qPCR的原理基于熒光探針（例如TaqMan探針或SYBR Green I染料）。這些探針通過與目標序列的特異性結合，在PCR過程中釋放熒光信號。
SYBR Green I：該染料能與DNA雙鏈結合，當PCR擴增產生新的雙鏈DNA時，SYBR Green I與其結合并發出熒光信號。
TaqMan探針：該探針由引物和熒光探針組成，熒光探針含有一個熒光染料和一個熒光猝滅劑。在PCR擴增過程中，熒光探針通過引物特異性結合到目標序列上，并且Taqpolymerase酵素的核酸酶活性會切除掉熒光探針上的猝滅劑，導致熒光染料釋放出信號。
PCR擴增中避免非特異性產物的綜合策略
一、優化引物設計
提高引物特異性
確保引物與目標序列高度匹配，避開非目標區域的相似序列（如通過BLAST比對驗證）；
引物長度控制在18-24 bp，GC含量40–60%，避免引物二聚體或發夾結構。
減少引物濃度
過高引物濃度易引發非特異性結合或引物二聚體，建議調整至0.1–0.5 μM。
二、調控PCR反應條件
調整退火溫度
適當提高退火溫度?（接近引物Tm值±2℃），增強引物與模板結合的嚴謹性，減少非特異性結合。
優化Mg2?濃度
Mg2?濃度過高（＞2.5 mM）會降低反應特異性，需通過梯度實驗確定最佳濃度（通常1.5–2.5 mM）。
縮短延伸時間與循環次數?
延伸時間按產物長度設定（1 kb/min），避免過度延伸導致副產物積累；
減少循環次數（通常25–35次），防止非特異性產物指數級擴增。
使用熱啟動Taq酶
熱啟動聚合酶在低溫下無活性，可抑制早期非特異性擴增。
三、防污染操作
分區操作?
實驗區域分為樣本處理區、試劑配制區及擴增區，避免氣溶膠污染。
使用UNG酶
添加尿嘧啶糖基化酶（UNG）降解含dU的污染產物，抑制殘留DNA擴增。
設置陰性對照
加入無模板對照（NTC）以監測試劑或環境污染物。
四、模板與試劑優化
純化模板DNA
模板降解或雜質（如多糖、蛋白）可能引發非特異性擴增，需通過電泳或純化試劑盒驗證完整性。
調整模板用量
過高模板量會增加非特異性結合的幾率，建議按實驗體系推薦量添加（通常1–100 ng）。
五、其他輔助策略
使用降落PCR（Touchdown PCR）
初始退火溫度高于Tm值并逐漸降低，優先擴增高特異性產物45。
添加增強劑?
DMSO（5–10%）、甜菜堿（1–1.5 M）等可減少模板二級結構干擾，提升特異性。
巢式PCR
分兩輪擴增，使用外側和內側兩對引物，降低背景干擾
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