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上海雅吉生物科技有限公司

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PCR三個基本反應步驟

閱讀:870      發布時間:2024-5-15
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標準的PCR三個基本反應步驟:


第一步,DNA變性(90℃-96℃)


雙鏈DNA在高溫作用下,氫鍵斷裂,形成單鏈DNA。


第二步,退火(60℃-65℃)


溫度降低,引物與DNA模板結合,形成局部雙鏈。


第三步,延伸(70℃-75℃)


在Taq酶的作用下,以dNTP為原料,從引物的3′端開始以從5′到3′端的方向延伸,合成與模板互補的DNA鏈。


每一循環經過變性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。


PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成:模板DNA的變性模板DNA經加 熱至93℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增

形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備;模板DNA與引 物的退火(復性)模板DNA經加熱變性成單鏈后

,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;引物的延伸DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,

以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈,重復循環變性--

退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復制鏈",而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需 2~4分鐘,

2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。P

CR的反應動力學 PCR的三個反應步驟反復進行,使DNA擴增量呈指數上升。反應最終的DNA 擴增量可用Y=(1+X)n計算。

Y代表DNA 段擴增后的拷貝數,X表示平(Y)均每次的擴增效率,n代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100%,

 但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期,靶序列DNA 段的增加呈指數形式,隨著PCR產物的逐漸積累,

被擴增的DNA 段不再呈指數增加,而進 入線性增長期或靜止期,即出現“停滯效應",這種效應稱平臺期數、PCR擴增效率及DNA聚合酶

內源性逆轉錄.png

PCR的種類和活性及非特異性產物的競爭等因素。大多數情況下,平臺期的到來是不可避免的。


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