一、基本信息

1. 組成與結(jié)構(gòu)

• 生物素（Biotin）：
  又稱維生素 H 或輔酶 R，是一種小分子水溶性維生素，其分子結(jié)構(gòu)中的咪唑酮環(huán)可與親和素（Avidin）或鏈霉親和素（Streptavidin）以 ** 高親和力（Kd≈10?1? M）** 特異性結(jié)合，常用于生物分子的標(biāo)記與檢測(cè)。

• 依帕司他（Epalrestat）：
  是一種醛糖還原酶抑制劑（ARI），化學(xué)名為 N - (1,3 - 二噻烷 - 2 - 基甲基) - 5 - 甲基 - 2 - 苯基呋喃 - 3 - 甲酰胺，分子式為 $C_{15}{H}_{15}N{O}_2{S}_2$，分子量為 303.42。

• 生物素標(biāo)記依帕司他：
  通過化學(xué)偶聯(lián)技術(shù)將生物素分子連接到依帕司他的特定官能團(tuán)（如氨基、巰基等）上，形成具有靶向識(shí)別能力的標(biāo)記化合物。

二、制備方法

1. 關(guān)鍵步驟

（1）生物素衍生物的活化

• 生物素 - N - 羥基琥珀酰亞胺酯（Biotin - NHS）：適用于與依帕司他分子中的氨基（$?N{H}_2$）反應(yīng)。

• 生物素 - 馬來酰亞胺（Biotin - Maleimide）：適用于與巰基（$?SH$）反應(yīng)（若依帕司他結(jié)構(gòu)中含巰基或經(jīng)修飾引入巰基）。

• 活化條件：將生物素衍生物溶于有機(jī)溶劑（如 DMSO、DMF），加入堿（如 DIPEA）調(diào)節(jié) pH 至弱堿性（pH 7.5 - 9.0），促進(jìn)活化反應(yīng)。

（2）偶聯(lián)反應(yīng)

• 若依帕司他含氨基，可與 Biotin - NHS 的 NHS 酯基反應(yīng)，生成酰胺鍵連接的標(biāo)記物。

• 反應(yīng)時(shí)間通常為1 - 4 小時(shí)，需通過薄層層析（TLC）或高效液相色譜（HPLC）監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)度。

（3）純化與表征

• 純化方法：利用柱層析（如硅膠柱或反相柱）、制備型 HPLC 或透析法去除未反應(yīng)的生物素、溶劑及副產(chǎn)物。

• 結(jié)構(gòu)確證：通過質(zhì)譜（MS，如 ESI - MS）驗(yàn)證分子量，核磁共振（NMR）確認(rèn)官能團(tuán)連接位置，紫外 - 可見光譜（UV - Vis）檢測(cè)特征吸收峰。

三、特性與優(yōu)勢(shì)

1. 高特異性與靈敏度

2. 保留藥理活性

3. 操作便捷性

四、應(yīng)用領(lǐng)域

1. 藥物代謝與動(dòng)力學(xué)研究

• 體內(nèi)追蹤：通過生物素標(biāo)記依帕司他，結(jié)合親和素捕獲技術(shù)，可定量分析藥物在血液、組織中的濃度及消除速率，揭示其代謝產(chǎn)物與靶點(diǎn)結(jié)合的時(shí)空分布。

• 靶點(diǎn)識(shí)別：利用生物素標(biāo)記物進(jìn)行親和層析或蛋白質(zhì)組學(xué)分析，釣取與依帕司他直接結(jié)合的蛋白，闡明其作用機(jī)制（如潛在的非醛糖還原酶靶點(diǎn)）。

2. 生物檢測(cè)與分析

• ELISA 檢測(cè)：將生物素標(biāo)記依帕司他作為競(jìng)爭(zhēng)抗原，用于檢測(cè)生物樣品（如血清）中的依帕司他濃度，輔助臨床藥物監(jiān)測(cè)。

• 免疫熒光成像：結(jié)合熒光標(biāo)記親和素，在細(xì)胞或組織水平觀察依帕司他的攝取與分布，研究其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制或細(xì)胞內(nèi)作用位點(diǎn)。

3. 靶向藥物開發(fā)

• 雙功能分子設(shè)計(jì)：生物素標(biāo)記依帕司他可進(jìn)一步與腫*細(xì)胞表面特異性表達(dá)的親和素受體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)腫*靶向給藥，減少對(duì)正常組織的毒性。

• 藥物載體偶聯(lián)：將標(biāo)記物連接到納米載體（如脂質(zhì)體、聚合物膠束）表面，通過親和素 - 生物素相互作用增強(qiáng)載體對(duì)病變部位的富集效率。

4. 酶活性分析

五、注意事項(xiàng)

1. 標(biāo)記位點(diǎn)選擇：需避免生物素連接至依帕司他的活性中心（如與醛糖還原酶結(jié)合的關(guān)鍵基團(tuán)），可通過分子對(duì)接模擬預(yù)測(cè)最佳標(biāo)記位置。

2. 溶劑兼容性：依帕司他水溶性較差，反應(yīng)體系中需加入適量有機(jī)溶劑（如 DMSO）助溶，但需控制濃度以避免蛋白變性或細(xì)胞毒性。

3. 穩(wěn)定性驗(yàn)證：標(biāo)記物需在生理?xiàng)l件（pH 7.4、37℃）下驗(yàn)證穩(wěn)定性，避免生物素 - 連接鍵過早斷裂導(dǎo)致信號(hào)丟失。

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