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摘要：本文聚焦于 Ag85B 成熟蛋白基因在結(jié)核病免疫研究中的新突破。闡述了 Ag85B 蛋白在結(jié)核分枝桿菌中的重要地位，詳細(xì)描述了圍繞其成熟蛋白基因開(kāi)展的一系列實(shí)驗(yàn)，包括基因克隆、表達(dá)載體構(gòu)建、免疫動(dòng)物模型的建立以及免疫效果評(píng)價(jià)等。研究結(jié)果顯示了 Ag85B 成熟蛋白基因在結(jié)核病免疫預(yù)防和治療方面的巨大潛力，為新型結(jié)核病疫苗的研發(fā)和免疫治療策略提供了重要理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

一、引言

結(jié)核病（Tuberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的慢性傳染病。盡管目前已有卡介苗（BCG）等預(yù)防手段，但由于其保護(hù)效果有限，尤其是對(duì)成人肺結(jié)核的保護(hù)作用不足，全球結(jié)核病疫情依然嚴(yán)峻。因此，尋找更有效的結(jié)核病防治策略迫在眉睫。

Ag85B 蛋白是結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白家族中的重要成員，在結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)、致病以及免疫反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用。Ag85B 蛋白參與細(xì)胞壁合成，與結(jié)核分枝桿菌在宿主體內(nèi)的存活和繁殖密切相關(guān)。同時(shí)，它也是一種強(qiáng)效的免疫原，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。然而，以往對(duì)于 Ag85B 的研究多集中在其全蛋白水平，對(duì)于其成熟蛋白基因的研究尚未充分挖掘其潛力。本研究旨在深入探索 Ag85B 成熟蛋白基因在結(jié)核病免疫中的作用，以期為結(jié)核病的免疫防治帶來(lái)新的突破。

二、材料與方法

（一）材料

菌株與質(zhì)粒
結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 H37Rv 用于獲取 Ag85B 基因。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 和 BL21（DE3）菌株分別用于基因克隆和蛋白表達(dá)。表達(dá)載體選用 pET - 28a（+），該載體帶有 His - Tag 標(biāo)簽，便于后續(xù)蛋白純化和檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
選用 6 - 8 周齡的 C57BL/6 小鼠，體重約 20 - 22g，購(gòu)自正規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在符合倫理規(guī)范的條件下進(jìn)行。

主要試劑
限制性?xún)?nèi)切酶（如 BamHI、HindIII）、T4 DNA 連接酶、DNA 聚合酶、RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、胎牛血清、RPMI - 1640 培養(yǎng)基、弗氏完整佐劑和弗氏不完整佐劑等。

（二）方法

Ag85B 成熟蛋白基因的克隆

結(jié)核分枝桿菌基因組 DNA 的提取：將結(jié)核分枝桿菌 H37Rv 菌株接種于改良羅氏培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。收集細(xì)菌，采用細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒提取基因組 DNA。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的 DNA 質(zhì)量和濃度。

引物設(shè)計(jì)：根據(jù) GenBank 中公布的結(jié)核分枝桿菌 Ag85B 基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物。引物兩端分別引入 BamHI 和 HindIII 限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，以方便后續(xù)與表達(dá)載體的連接。同時(shí)，確保引物擴(kuò)增的區(qū)域?yàn)榫幋a Ag85B 成熟蛋白的基因序列。

PCR 擴(kuò)增：以提取的結(jié)核分枝桿菌基因組 DNA 為模板，加入設(shè)計(jì)好的引物、dNTPs、DNA 聚合酶等進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件經(jīng)過(guò)優(yōu)化，包括變性溫度、退火溫度和延伸時(shí)間等。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并用膠回收試劑盒回收目的條帶。

表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

載體和目的基因的雙酶切：將回收的 PCR 產(chǎn)物和表達(dá)載體 pET - 28a（+）分別用 BamHI 和 HindIII 進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)在適宜的緩沖體系中進(jìn)行，37℃孵育一定時(shí)間后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，并再次回收目的基因片段和線(xiàn)性化的載體。

連接與轉(zhuǎn)化：將雙酶切后的目的基因和載體按照一定比例混合，加入 T4 DNA 連接酶，在 16℃下連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于含有卡那霉素的 LB 平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，篩選陽(yáng)性克隆。

重組質(zhì)粒的鑒定：挑取平板上的單菌落，接種于含有卡那霉素的 LB 液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，采用限制性?xún)?nèi)切酶酶切和 DNA 測(cè)序的方法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，確保插入的基因序列正確無(wú)誤。

Ag85B 成熟蛋白的表達(dá)與純化

蛋白表達(dá)：將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落接種于含有卡那霉素的 LB 液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至 OD???約為 0.6 - 0.8。加入 IPTG（異丙基 - β - D - 硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)條件（如 IPTG 濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和溫度）經(jīng)過(guò)優(yōu)化。收集誘導(dǎo)后的菌液，通過(guò)超聲破碎細(xì)胞，釋放蛋白。

蛋白純化：采用鎳 - 瓊脂糖親和層析柱對(duì)帶有 His - Tag 標(biāo)簽的 Ag85B 成熟蛋白進(jìn)行純化。將破碎后的細(xì)胞上清液上樣至親和層析柱，用不同濃度的咪唑緩沖液進(jìn)行洗脫，收集含有目的蛋白的洗脫峰。通過(guò) SDS - PAGE 電泳和 Western blotting 檢測(cè)純化后的蛋白純度和分子量。

動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)

免疫方案：將純化后的 Ag85B 成熟蛋白與弗氏完整佐劑等體積混合，充分乳化后，皮下注射 C57BL/6 小鼠，每只小鼠注射蛋白量為 50μg。初次免疫后，于第 2 周和第 4 周分別用弗氏不完整佐劑與蛋白混合進(jìn)行加強(qiáng)免疫，劑量同初次免疫。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，注射 PBS 和佐劑的混合物。

免疫效果評(píng)價(jià)

細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)：在末次免疫后 2 周，處死小鼠，分離脾淋巴細(xì)胞。采用 MTT 法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞的增殖活性，以結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激脾淋巴細(xì)胞，觀(guān)察其增殖情況。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) CD4?和 CD8?T 淋巴細(xì)胞的比例和細(xì)胞因子（如 IFN - γ、IL - 2、IL - 4 等）的分泌水平，評(píng)估細(xì)胞免疫應(yīng)答狀態(tài)。

體液免疫反應(yīng)檢測(cè)：采集小鼠血清，采用 ELISA 法檢測(cè)血清中抗 - Ag85B 抗體的水平，包括 IgG、IgM 等不同類(lèi)型抗體，以評(píng)估體液免疫應(yīng)答。

免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)：末次免疫后 4 周，用結(jié)核分枝桿菌 H37Rv 菌株對(duì)小鼠進(jìn)行氣溶膠感染，感染劑量根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。感染后定期觀(guān)察小鼠的體重變化、生存率以及肺部病理變化。通過(guò)菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)小鼠肺部結(jié)核分枝桿菌的載量，評(píng)估免疫保護(hù)效果。

三、結(jié)果

（一）Ag85B 成熟蛋白基因的克隆

PCR 擴(kuò)增得到了預(yù)期大小的目的基因片段，瓊脂糖凝膠電泳顯示條帶清晰，大小與理論值相符。經(jīng)膠回收后，獲得了足夠量的 Ag85B 成熟蛋白基因片段，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

（二）表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

雙酶切和 DNA 測(cè)序結(jié)果表明，成功構(gòu)建了含有 Ag85B 成熟蛋白基因的重組表達(dá)載體 pET - 28a - Ag85B。重組質(zhì)粒在大腸桿菌中能夠穩(wěn)定存在，為蛋白表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

（三）Ag85B 成熟蛋白的表達(dá)與純化

經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)后，SDS - PAGE 電泳結(jié)果顯示在預(yù)期分子量位置出現(xiàn)了明顯的蛋白條帶，表明 Ag85B 成熟蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)。通過(guò)鎳 - 瓊脂糖親和層析柱純化后，獲得了高純度的 Ag85B 成熟蛋白，Western blotting 結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了純化蛋白的正確性。

（四）動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果

細(xì)胞免疫反應(yīng)

脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞在結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激下增殖明顯高于對(duì)照組。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，免疫組小鼠 CD4?和 CD8?T 淋巴細(xì)胞比例顯著增加，且 IFN - γ、IL - 2 等 Th1 型細(xì)胞因子分泌水平升高，提示產(chǎn)生了強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答，以 Th1 型免疫反應(yīng)為主。

體液免疫反應(yīng)
ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，免疫組小鼠血清中抗 - Ag85B 抗體水平明顯升高，其中 IgG 抗體水平升高尤為顯著，表明誘導(dǎo)了有效的體液免疫反應(yīng)。

免疫保護(hù)效果

在免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，免疫組小鼠在結(jié)核分枝桿菌感染后體重下降幅度明顯小于對(duì)照組，生存率顯著提高。肺部病理檢查發(fā)現(xiàn)，免疫組小鼠肺部炎癥反應(yīng)較輕，結(jié)核結(jié)節(jié)數(shù)量和大小均明顯小于對(duì)照組。菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，免疫組小鼠肺部結(jié)核分枝桿菌載量顯著低于對(duì)照組，表明 Ag85B 成熟蛋白免疫能夠?yàn)樾∈筇峁┯行У拿庖弑Ｗo(hù)。

四、討論

本研究成功克隆并表達(dá)了 Ag85B 成熟蛋白基因，通過(guò)動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其在結(jié)核病免疫中的良好效果。Ag85B 成熟蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生以 Th1 型為主的細(xì)胞免疫反應(yīng)和較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)，這對(duì)于抵抗結(jié)核分枝桿菌感染至關(guān)重要。

在細(xì)胞免疫方面，Th1 型細(xì)胞因子的分泌能夠激活巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)其殺傷結(jié)核分枝桿菌的能力。同時(shí)，CD4?和 CD8?T 淋巴細(xì)胞的增殖和活化有助于形成長(zhǎng)期的免疫記憶，為機(jī)體提供持久的保護(hù)。在體液免疫方面，抗體的產(chǎn)生可能通過(guò)多種機(jī)制參與抗結(jié)核免疫，如中和毒素、調(diào)理吞噬等。

然而，本研究也存在一些局限性。例如，在動(dòng)物模型選擇上，僅使用了 C57BL/6 小鼠模型，對(duì)于其他動(dòng)物模型或人類(lèi)的適用性還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，雖然 Ag85B 成熟蛋白顯示出了良好的免疫效果，但在實(shí)際應(yīng)用中，可能需要考慮與其他結(jié)核分枝桿菌抗原聯(lián)合使用，以進(jìn)一步提高免疫保護(hù)效果。同時(shí)，還需要深入研究其免疫機(jī)制，為疫苗的優(yōu)化設(shè)計(jì)提供更充分的理論依據(jù)。

五、結(jié)論

本研究在 Ag85B 成熟蛋白基因結(jié)核病免疫研究方面取得了新突破。通過(guò)構(gòu)建表達(dá)載體、純化蛋白和進(jìn)行動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)，證明了 Ag85B 成熟蛋白在誘導(dǎo)免疫反應(yīng)和提供免疫保護(hù)方面的顯著作用。這為新型結(jié)核病疫苗的研發(fā)和免疫治療策略提供了有價(jià)值的參考，為進(jìn)一步改善全球結(jié)核病防治現(xiàn)狀帶來(lái)了希望。未來(lái)的研究將圍繞優(yōu)化免疫方案、深入理解免疫機(jī)制以及開(kāi)展臨床試驗(yàn)等方面展開(kāi)，以期早日將這一研究成果應(yīng)用于臨床實(shí)踐。