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qPCR實驗的注意事項有哪些?

閱讀:1526      發(fā)布時間:2024-3-6
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  q是指在PCR體系中加入熒光染料或熒光探針,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過C-值和標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。那么你知道qPCR實驗的注意事項有哪些嗎?讓我們一起來看看吧!
 
  一、模板制備
 
  在進行qPCR實驗時,需要根據所用試劑盒說明書加入適量的起始核酸模板,過多的模板可能提高污染物含量,大大降低 PCR 效率,過少的模板可能會降低檢測靈敏性和重復性。
 
  根據檢測靶標的性質特點,選擇合適的核酸抽提試劑盒同樣至關重要。小編有遇到老師想要通過qPCR的方法完成對microRNA的定量,但是發(fā)現待檢測樣本中目標microRNA和內參基因的擴增曲線出峰時間都比較晚,內參基因的Ct值甚至大于30(圖2)。排除實驗操作問題后發(fā)現原來是因為所使用RNA抽提試劑盒對小片段的microRNA回收效率低,不適合用于下游microRNA定量實驗。
 
  二、引物探針的設計及儲存
 
  除了要保證模板的質量外,引物探針的設計和穩(wěn)定性同樣至關重要。當我們根據檢測靶標設計特異性引物和探針時,除了要考慮片段長度,Tm值,堿基組成等基本要點外,還需格外注意引物,探針自身不能形成復雜的二級結構,上下游引物內部,引物探針之間不能出現結合的現象,因為這些都可能影響引物探針與目標基因的結合,進而影響最終的擴增效率。
 
  除了引物探針在設計時需要格外花費心思外,收到合成好的引物、探針如何稀釋,如何保存同樣有小tips。如果我們合成的引物探針是干粉狀或是需要稀釋時,為了保證引物探針的穩(wěn)定性建議用1×TE buffer去溶解和稀釋。另外,引物的儲存濃度也可能影響其穩(wěn)定性,建議引物的儲存濃度不低于 10 μM,一般為100 μM 。此外如果引物和探針每次使用量較少時,還應該進行分裝,保存在-20℃,以減少反復凍融的次數。
 
  更多有關qPCR實驗的注意事項,請聯系天津益元利康生物科技有限公司。

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