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己糖激酶(hexokinase,HK)試劑盒說明書

閱讀:422      發布時間:2023-10-24
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己糖激酶(hexokinaseHK)試劑盒說明書

                                          微量法 100/96

 

   正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義

HKEC 2.7.1.1)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,是葡萄糖分解過程中的第一個關鍵酶,催化葡萄糖轉化為6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途徑的交叉點。

 

測定原理

HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脫氫酶進一步催化6-磷酸葡萄糖脫氫生成NADPHNADPH340nm有特征吸收峰。

 

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制

提取液:100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體20mL×1瓶, 4保存;

試劑二:粉劑×1瓶,4保存;

試劑三:粉劑×1支,-20保存;

 

樣本的前處理

1、細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

2、組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

3、血清(漿)樣品:直接檢測。

 

測定步驟

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至340nm,蒸餾水調零。

2、  樣本測定

1)在試劑二中加入18mL試劑一充分溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴5min用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

2)在試劑三中加入1mL試劑一,充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

3)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑三和180μL試劑二,混勻,立即記錄340nm20s時的吸光值A1 5min20s后的吸光值A2計算ΔA=A2-A1

注意:不同勻漿組織中HK活力不一樣,做正式試驗之前請做1-2只預試,若ΔA>0.5,則說明組織活力太

 

高,必須用提取液稀釋成適當濃度勻漿上清液(計算公式中乘以相應稀釋倍數),或縮短反應時間至2min,使ΔA<0.5,以提高檢測靈敏度。

 

HK活性計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清(漿)HK活性

單位的定義:每毫升血清(漿)在每分鐘生成1 nmolNADPH定義為一個酶活力單位。

HKnmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷V÷T=643×ΔA

2、組織、細菌或細胞中HK活性

1)按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmolNADPH定義為一個酶活力單位。

HKnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmolNADPH定義為一個酶活力單位。

HKnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W ×V÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmolNADPH定義為一個酶活力單位。

HKnmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總) ÷T=1.286×ΔA

V反總:反應體系總體積,2×10-4 LεNADPH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.01 mLV樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應時間,5 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細菌或細胞總數,500萬。

 

b.96孔板測定的計算公式如下

1、血清(漿)HK活性

單位的定義:每毫升血清(漿)在每分鐘生成1 nmolNADPH定義為一個酶活力單位。

HKnmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷V÷T=1286×ΔA

2、組織、細菌或細胞中HK活性

1)按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmolNADPH定義為一個酶活力單位。

HKnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmolNADPH定義為一個酶活力單位。

HKnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmolNADPH定義為一個酶活力單位。

HKnmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總)÷T=2.572×ΔA

V反總:反應體系總體積,2×10-4 LεNADPH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cmd96孔板光徑,0.5cmV樣:加入樣本體積,0.01 mLV樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應時間,5 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細菌或細胞總數,500萬。

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