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木質素過氧化物酶(Lignin peroxidase,Lip)試劑盒說明書

閱讀:417      發布時間:2023-10-20
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木質素過氧化物酶(Lignin peroxidase,Lip)試劑盒說明書

         微量法100T/96S

 

注   意 :正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

木質素過氧化物酶(EC1.11.1.14)是一種含亞鐵血紅素的過氧化物酶,屬于木質素降解酶系,在木質素生物降解、造紙工業、紡織工業、芳香化合物轉化與降解及環境污染控制等方面具有較大的應用潛力。

 

測定原理:

木質素過氧化物酶催化天青脫甲基,在651nm處測定吸光值減少。

 

自備實驗用品及儀器:

天平、研缽、低溫離心機、酶標儀、96孔板、可調式移液器、冰。

 

試劑組成和配制: 

試劑一:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入115mL蒸餾水,充分溶解待用,用不完的試劑4℃保存一個月。

試劑二:液體5mL×1瓶,4℃避光保存。

試劑三:液體5mL×1支,4℃保存。

 

酶液提取:

1.        組織:按照質量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL試劑一)加入試劑一,冰浴勻漿后于4℃,10000g離心10min,取上清置于冰上待測。

2.        細胞:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后4℃,10000g離心10min,取上清置于冰上待測。

3.        培養液或其它液體:直接檢測。                        

 

測定操作:

1、酶標儀預熱30min以上,調節波長至651nm。

2、臨用前按每個樣本試劑一:試劑二:試劑三=80:40:40(μL)的比例配制工作液,現配現用。

3、在96孔板中依次加入如下試劑


測定管

樣品(μL)

40

工作液(μL)

160

充分混勻,立即測定651nm處10s和130s吸光值,記為A1和A2,△A=A1- A2

 

 

酶活計算公式:

1.按照蛋白濃度計算

酶活性定義:每mg組織蛋白在每mL反應體系中每分鐘A651變化0.01為一個酶活力單位。

LiP活性(U/mg prot)= ΔA×V反總÷(V樣×Cpr)÷0.01÷T =250×ΔA÷Cpr

 

2.按照樣本質量計算

酶活性定義:每g組織在每mL反應體系中每分鐘A651變化0.01為一個酶活力單位。

LiP活性(U/g 鮮重)=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =250×ΔA÷W

3.按照細胞數量計算

酶活性定義:每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中每分鐘A651變化0.01為一個酶活力單位。

LiP活性(U/104 cell)=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T=0.5×ΔA

4.按照液體體積計算

酶活性定義:每mL血清(漿)在每mL反應體系中每分鐘A651變化0.01為一個酶活力單位。

LiP活性(U/mL)=ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T =250×ΔA

V反總:反應總體積,0.2mL;V樣:反應中樣本體積,0.04mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;T:反應時間,2min

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優利科(上海)生命科學有限公司

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