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硫氧還蛋白氧化還原酶(thioredoxin reductase, TrxR)試劑盒說明書

閱讀:414      發布時間:2023-10-17
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硫氧還蛋白氧化還原酶thioredoxin reductase, TrxR試劑盒說明書

                                                  微量法100T/96S

 

    意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

TrxR是一種NADPH依賴的包含FAD結構域的二聚體硒酶,屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員,與硫氧還蛋白以及NADPH共同構成了硫氧還蛋白系統。TrxRGR活性類似,催化GSSG還原生成GSH,是谷胱甘肽氧化還原循環關鍵酶之一。

 

測定原理:

TrxR催化NADPH還原DTNB生成TNBNADP+TNB412 nm有特征吸收峰,通過測定412nm波長處TNB的增加速率,即可計算TrxR活性。

 

自備儀器和用品:

低溫離心機、可調節移液器、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體120mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體2mL×1瓶,4℃避光保存。

試劑三:粉劑×1管,4℃保存。臨用前加入2mL蒸餾水溶解。

 

粗酶液提取:

1.        組織:按照組織質量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。8000g4離心10min,取上清置冰上待測。

2.        細菌、真菌:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g4,離心10min,取上清置于冰上待測。

3.  血清等液體:直接測定。

 

TrxR測定操作:

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min,調節波長到412nm,用蒸餾水調零。

2. 試劑一在25℃(一般物種)或者37℃(哺乳動物)預熱30min

3. 空白管:取微量玻璃比色皿或96孔板,加入20μL試劑二,20μL試劑三,160μL試劑一,迅速混勻后于412 nm測定10 s310 s吸光度,記為A1A2△A空白管=A2-A1

4. 測定管:取微量玻璃比色皿或96孔板,加入20μL試劑二,20μL試劑三,140μL試劑一,20μL上清液,迅速混勻后于412 nm測定10 s310 s吸光度,記為A3A4A測定管=A4-A3

注意:空白管只需測定一次。

 

 

TrxR活性計算公式:

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義:在25或者37中,每毫克蛋白每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。

TrxRnmol/min /mg prot=A測定管-A空白管)÷ε÷d×V反總÷(Cpr×V)÷T

= 147×A測定管-A空白管)÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義:在25或者37中,每克樣本每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。

TrxRnmol/min /g 鮮重=A測定管-A空白管)÷ε÷d×V反總÷(W×V÷V樣總)÷T

= 147×A測定管-A空白管)÷W

3)按細胞數量計算

活性單位定義:在25或者37中,每104個細胞每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。

TrxRnmol/min/104 cell=A測定管-A空白管)÷ε÷d×V反總÷(細胞數量×V÷V樣總)÷T

= 147×A測定管-A空白管)÷ 細胞數量

4)按液體體積計算

活性單位定義:在25或者37中,每毫升液體每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。

TrxRnmol/min /mL=A測定管-A空白管)÷ε÷d×V反總÷V÷T

= 147×A測定管-A空白管)

εTNB412nm處的微摩爾消光系數,0.0136 L/μ mol/cmd:比色皿光徑,1cmV反總:反應體系總體積(L),200μL=2×10-4 LCpr:上清液蛋白質濃度(mg/mL),需要另外測定;W :樣品質量;V樣:加入反應體系中上清液體積(mL),20μL=0.02 mLV樣總:提取液體積,1 mLT:反應時間(min),5 min

 

b.使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義:在25或者37中,每毫克蛋白每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。

TrxRnmol/min /mg prot=A測定管-A空白管)÷ε÷d×V反總÷(Cpr×V)÷T

= 294×A測定管-A空白管)÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義:在25或者37中,每克樣本每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。

TrxRnmol/min /g 鮮重=A測定管-A空白管)÷ε÷d×V反總÷(W×V÷V樣總)÷T

= 294×A測定管-A空白管)÷W

3)按細胞數量計算

活性單位定義:在25或者37中,每104個細胞每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。

TrxRnmol/min/104 cell=A測定管-A空白管)÷ε÷d×V反總÷(細胞數量×V÷V樣總)÷T

= 294×A測定管-A空白管)÷ 細胞數量

4)按液體體積計算

活性單位定義:在25或者37中,每毫升液體每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。

TrxRnmol/min /mL=A測定管-A空白管)÷ε÷d×V反總÷V÷T

= 294×A測定管-A空白管)

εTNB412nm處的微摩爾消光系數,0.0136 L/μ mol/cmd96孔板光徑,0.5cmV反總:反應體系總體積(L),200μL=2×10-4 LCpr:上清液蛋白質濃度(mg/mL),需要另外測定;W :樣品質量;V樣:

 

加入反應體系中上清液體積(mL),20μL=0.02 mLV樣總:提取液體積,1 mLT:反應時間(min),5 min

 

注意事項:

1.        測定前須先取12個樣做預實驗,哺乳動物組織及血液制品TrxR活力測定時,一般須用蒸餾水稀釋5倍左右;測定過程操作須迅速。

2.        試劑二和試劑三配制好后3天內使用完。

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