γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
GCL 是 GSH 合成的限速酶，GSH 對 GCL 有反饋抑制作用。GCL基因表達受多種因素調節，如氧化劑、抗氧化劑、生長因子和炎癥因子等。GCL活性高低對GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影響。
測定原理：
在ATP和Mg2+存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同時ATP去磷酸化產生無機磷分子，通過測定無機磷增加速率，即可計算出GCL活性。
自備儀器和用品：
冷凍離心機、水浴鍋、移液器、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、濃硫酸和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體105mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加6 mL蒸餾水充分震蕩溶解。
試劑三：粉劑×1管，4℃保存。臨用前加入蒸餾水1.5 mL充分震蕩溶解。
試劑四：液體7mL×1瓶，室溫保存。
試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入12 mL蒸餾水，充分震蕩溶解后，緩緩加入400µL濃硫酸（自備），邊加邊攪拌。
粗酶液提?。?/span>
1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2. 細菌、真菌：按照細胞數量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
3. 血清等液體：直接測定。
GCL測定操作：
1. 分光光度計/酶標儀預熱30min，調節波長到660nm，蒸餾水調零。
2. 空白管：取1.5mLEp管，依次加入試劑一48µL、試劑二52µL、試劑三12µL和蒸餾水24µL，混勻后蓋緊，37℃水浴準確反應15 min；再加入試劑四60µL，混勻后，室溫（25℃左右）8000g，離心10 min，取上清100µL，加入試劑五100µL，混勻后蓋緊，45℃水浴10min，冷卻后測定660nm處光吸收，記為A空白管。
3. 測定管：取1.5mLEp管，依次加入試劑一48µL、試劑二52µL、試劑三12µL和上清液24µL，混勻后蓋緊，37℃水浴準確反應15 min；再加入試劑四60µL，混勻后，室溫（25℃左右）8000g，離心10 min，
4. 取上清100µL，加入試劑五100µL，混勻后蓋緊，45℃水浴10min，冷卻后測定660nm處光吸收，記為A測定管。
注意：空白管只需要測定一次。
GCL活性計算公式：
標準曲線：y=0.1427x，R2=0.9987
a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義：37℃下，每毫克蛋白每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL（μg/min /mg prot）=[（A測定管-A空白管）÷0.1427×V反總]÷(Cpr×V樣)÷T
=3.815×（A測定管-A空白管）÷Cpr
（2）按樣本質量計算
活性單位定義：37℃下，每克組織每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為為1個酶活單位。
GCL（μg/min /g 鮮重）= [（A測定管-A空白管）÷0.1427×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 3.815×（A測定管-A空白管）÷W
（3）按細胞數量計算
活性單位定義：37℃下，每104個細胞每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL（μg/min /104 cell）=[（A測定管-A空白管）÷ 0.1427×V反總]÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T
= 3.815×（A測定管-A空白管）÷細胞數量
（4）按照液體體積計算
活性單位定義：37℃下，每毫升液體每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL（μg/min /mL）= [（A測定管-A空白管）÷ 0.1427×V反總]÷V樣÷T
= 3.815×（A測定管-A空白管）
0.1427：回歸方程系數；V反總：反應總體積（mL）196 µL=0.196 mL；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL； V樣：加入反應體系中上清液體積，24µL =2.4×10-2 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；W：樣本質量，g；T：反應時間：15min。
b. 使用96孔板測定的計算公式如下
標準曲線：y=0.07135x，R2=0.9987
（(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義：37℃下，每毫克蛋白每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL（μg/min /mg prot）= [（A測定管-A空白管）÷0.07135×V反總]÷(Cpr×V樣)÷T
=7.63×（A測定管-A空白管）÷Cpr
（2）按樣本質量計算
活性單位定義：37℃下，每克組織每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為為1個酶活單位。
GCL（μg/min /g 鮮重）= [（A測定管-A空白管）÷0.07135×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 7.63×（A測定管-A空白管）÷W
（3）按細胞數量計算
活性單位定義：37℃下，每104個細胞每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL（μg/min /104 cell）=[（A測定管-A空白管）÷0.07135×V反總]÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T
= 7.63×（A測定管-A空白管）÷細胞數量
（4）按照液體體積計算
活性單位定義：37℃下，每毫升液體每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL（μg/min /mL）= [（A測定管-A空白管）÷0.07135×V反總]÷V樣÷T
=7.63×（A測定管-A空白管）
0.07135：回歸方程系數；V反總：反應總體積（mL）196 µL=0.196 mL；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL； V樣：加入反應體系中上清液體積，24µL =2.4×10-2 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應時間：15min。
注意事項：
（1）樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力，以免影響其活力。如果是勻漿液，避免反復凍融。
（2）所有試劑配制完后，除表明4℃保存外，請于1天內用完。
（3）實驗過程請帶手套，試劑三中有強腐蝕性物質，注意不要濺到皮膚上或眼睛內。
（4）測定吸光值時請于水浴后10～40分鐘內測完。
（5）樣本測定前先取1-2個樣做預實驗，如吸光值太高，應先用試劑一(或者生理鹽水)稀釋到適當倍數，使得吸光值在標準曲線范圍內，哺乳動物組織和血液一般稀釋3～5倍。
（6）試劑三配制過程中，可能會產生黑色固體，其不影響結果，注意吸取時不要將黑色固體吸入。
（7）細胞中GCL活性測定時，細胞數目須在300萬-500萬之間，細胞中GCL的提取時可加試劑一（或生理鹽水）后研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞
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