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線粒體蘋果酸脫氫酶(MDHm)試劑盒說明書

閱讀:468      發(fā)布時間:2023-06-09
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線粒體蘋果酸脫氫酶(MDHm試劑盒說明書

                                  微量法100/96

 

   意 :正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:

MDH EC 1.1.1.37)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,線粒體中MDHTCA循環(huán)的關(guān)鍵酶之一,催化蘋果酸形成草酰乙酸;相反,胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物, 連接多條重要的代謝途徑。因此,MDH在細胞多種生理活動中扮演著重要的角色,包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性,MDH分為NAD-依賴的MDHNADP-依賴的MDH,細菌中通常只含有NAD-MDH,在真核細胞中,NAD-MDH分布于細胞質(zhì)和線粒體中。

 

測定原理:

MDHm催化NADH還原草酰乙酸生成蘋果酸,導致340nm處光吸收下降。

 

需自備的儀器和用品:

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

試劑一:100mL×1瓶,-20保存;

試劑二:20mL×1瓶,-20保存;

試劑三:1.5mL×1支,-20保存;

試劑四、液體20 mL×1瓶,在4保存;

試劑五、粉劑×1瓶,-20保存;

 

樣本測定的準備:

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

1、   稱取約0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、   將勻漿液于600g4離心5min

3、   棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g4離心10min

4、   上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的MDH(此步可選做)。

5、   在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復(fù)30次),用于MDHm活性測定。

 

測定步驟:

1、  分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、檢測工作液的配制:用時在試劑五中加入19mL試劑四和0.5mL蒸餾水,充分混勻待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

3、測定前將檢測工作液在37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min以上。

4、在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL樣本和195μL工作液,混勻后立即記錄340nm20s時的吸

 

光值A1 1min20s后的吸光值A2計算ΔA=A1-A2

 

MDHm活力單位的計算:

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

MDHmnmol/min/mg prot=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位

MDHmnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109W× V÷V樣總)÷T =1299×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

MDHmnmol/min/104 cell=[ΔA×V反總÷ε×d×1092000×V÷V樣總)÷T=0.65×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 LεNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.005 mLV樣總:加入提取液體積,0.202mLT:反應(yīng)時間,1 minW:樣本質(zhì)量,gCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL2000:細胞或細菌總數(shù),2000萬。

 

b.96孔板測定的計算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

MDHmnmol/min/mg prot=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

MDHmnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109W× V÷V樣總)÷T =2598×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

MDHmnmol/min/104 cell=[ΔA×V反總÷ε×d×1092000×V÷V樣總)÷T=1.3×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 LεNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cmd96孔板光徑,0.5cmV樣:加入樣本體積,0.005 mLV樣總:加入提取液體積,0.202 mLT:反應(yīng)時間,1 minW:樣本質(zhì)量,gCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL2000:細胞或細菌總數(shù),2000萬。

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